CaaX-prenyltransferases are essential for expression of genes involved in the early stages of monoterpenoid biosynthetic pathway in Catharanthus roseus cells
- 作者
- Vincent Courdavault, Martine Thiersault, Martine Courtois, Pascal Gantet, Audrey Oudin, Pierre Doireau, Benoit St-Pierre, Nathalie Giglioli-Guivarc'h
- 单位
- Université François-Rabelais de Tours, EA 2106 «Biomolécules et Biotechnologies Végétales», Labaratoire de Physiologie Végétale, UFR Science et Techniques, Parc de Grandmont, 37200 Tours, France; Université François-Rabelais de Tours, EA 2106 «Biomodécules et Biotechnologies Végétales», Labaratoire de Biologie Moléculaire et Biochimie Végétale, UFR Science Pharmaceutiques, 31 avenue Monge, 37200 Tours, France; Université Montpellier II «Equipe analyse fonctionnelle du génome du Riz», C.C. 002, 34095 Montpellier Cedex 5, France
- 杂志
- Plant Molecular Biology（2005）
- DOI
- 10.1007/s11103-005-3095-0
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
CaaX-异戊烯基转移酶（蛋白法尼基转移酶PFT和Ⅰ型香叶基香叶基转移酶PGGT-I）是否及如何参与长春花（Catharanthus roseus）细胞单萜吲哚生物碱（MIA）生物合成途径早期基因（ESMB基因）的表达调控
研究策略
利用RNA干扰分别沉默PFT和PGGT-I的β亚基基因，获得转基因细胞系；同时使用广谱异戊烯基转移酶抑制剂s-紫苏醇（SP）和特异性PFT抑制剂Manumycin A处理野生型细胞；并通过外源补充单萜合成中间产物进行回补实验，验证CaaX-异戊烯基转移酶对ESMB基因表达和MIA生物合成的必要性
核心内容
该研究以长春花C20D悬浮细胞为对象，探讨CaaX异戊烯基转移酶（蛋白法尼基转移酶PFT和Ⅰ型香叶基香叶基转移酶PGGT-I）在单萜吲哚生物碱（MIA）生物合成中的作用。通过RNA干扰分别沉默PFT和PGGT-I的β亚基基因，并利用广谱抑制剂s-紫苏醇和特异性PFT抑制剂Manumycin A处理细胞，结合外源中间产物回补实验验证功能。结果显示，沉默或抑制这两种酶可显著降低MEP途径和单萜环烯醚萜途径早期基因（Crdxs、Crdxr、Crg10h）的表达，但不影响下游Crsls、Crstr、Crtdc基因；1 mM s-紫苏醇处理使阿吗碱积累降低98%，同时完全消除2,4-D去除对早期基因的转录诱导作用。外源补充500 μM裂环马钱苷可完全恢复抑制剂处理细胞的阿吗碱积累，而脱氧木酮糖仅使对照细胞阿吗碱增加约36%。这些结果表明PFT和PGGT-I的蛋白底物是ESMB基因表达所必需的，其作用定位于MEP途径上游，揭示了植物蛋白异戊烯基转移酶在单萜生物合成调控中的新功能。
创新点
首次在植物中报道CaaX-异戊烯基转移酶（PFT和PGGT-I）参与单萜生物合成途径基因表达调控的新功能；结合RNAi和药理学抑制剂双重策略证明该作用；通过中间产物回补实验精确定位受影响的代谢步骤
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Catharanthus roseus C20D悬浮细胞系 | 蛋白异戊烯化修饰 | Crftb | 蛋白法尼基转移酶（PFT）β亚基 | 催化 | 编码PFT特异性β亚基，RNAi沉默导致ESMB基因表达下降 |
| Catharanthus roseus C20D悬浮细胞系 | 蛋白异戊烯化修饰 | Crcgt_Ib | Ⅰ型蛋白香叶基香叶基转移酶（PGGT-I）β亚基 | 催化 | 编码PGGT-I特异性β亚基，RNAi沉默导致ESMB基因表达下降 |
| Catharanthus roseus C20D悬浮细胞系 | 蛋白异戊烯化修饰 | Crfta/ggt_Ia | CaaX-异戊烯基转移酶共同α亚基 | 催化 | PFT和PGGT-I共享的α亚基 |
| Catharanthus roseus C20D悬浮细胞系 | MEP途径 | Crdxs | 1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合成酶（DXS） | 催化 | ESMB基因之一，其表达受CaaX-PTase活性影响 |
| Catharanthus roseus C20D悬浮细胞系 | MEP途径 | Crdxr | 1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶（DXR） | 催化 | ESMB基因之一，在CaaX-PTase活性降低时表达显著抑制 |
| Catharanthus roseus C20D悬浮细胞系 | 单萜环烯醚萜途径 | Crg10h | 香叶醇10-羟化酶（G10H） | 催化 | ESMB基因之一，其表达依赖CaaX-PTase活性 |
| Catharanthus roseus C20D悬浮细胞系 | 单萜吲哚生物碱合成（裂环马钱素合成） | Crsls | 裂环马钱苷合成酶（SLS） | 催化 | 其表达不受CaaX-PTase活性影响 |
| Catharanthus roseus C20D悬浮细胞系 | 单萜吲哚生物碱合成（缩合步骤） | Crstr | 异胡豆苷合成酶（STR） | 催化 | 其表达不受CaaX-PTase活性影响 |
| Catharanthus roseus C20D悬浮细胞系 | 色氨酸代谢/单萜吲哚生物碱合成 | Crtdc | 色氨酸脱羧酶（TDC） | 催化 | 其表达不受CaaX-PTase活性影响 |
关键发现
- 在C20D细胞系中，Crftb和Crcgt_Ib基因在培养周期早期表达，先于ESMB基因
- PFT和PGGT-I活性在PM培养基中第4-5天达到峰值。Crftb或Crcgt_Ib RNAi细胞系中，Crdxr和Crg10h表达显著降低，Crdxs轻度降低，MIA生物合成下降，细胞干重比对照低10%-20%。1 mM SP处理（第3天）使阿吗碱积累降低98%，第4天处理使阿吗碱降低60-70%
- 1 mM SP处理使阿吗碱降低80%且不显著影响干重
- 20 μM Manumycin A使阿吗碱降低70%。1 mM SP完全消除2,4-D去除对ESMB基因（Crdxs、Crdxr、Crg10h）转录的诱导作用，但不影响Crsls、Crstr、Crtdc表达。外源补充500 μM loganin、loganic acid或secologanin可完全恢复SP处理细胞的阿吗碱积累
- Manumycin A处理细胞仅secologanin可恢复。外源脱氧木酮糖使对照细胞阿吗碱积累增加约36%，但不能恢复抑制剂处理细胞的MIA积累。
研究结论
PFT和PGGT-I的蛋白底物是长春花细胞中ESMB基因表达和单萜吲哚生物碱合成所必需的，这代表了植物蛋白异戊烯基转移酶的一个此前未知的作用。