Pyruvate decarboxylase and alcohol dehydrogenase overexpression in Escherichia coli resulted in high ethanol production and rewired metabolic enzyme networks
- 作者
- Mingfeng Yang, Xuefeng Li, Chunya Bu, Hui Wang, Guanglu Shi, Xiushan Yang, Yong Hu, Xiaoqin Wang
- 单位
- Key Laboratory of Urban Agriculture (North) Ministry of Agriculture, Beijing University of Agriculture; College of Life Sciences, Capital Normal University
- 杂志
- World Journal of Microbiology and Biotechnology（2014）
- DOI
- 10.1007/s11274-014-1713-1
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
大肠杆菌缺乏同型乙醇发酵通路，导致乙醇产量低，需要异源表达运动发酵单胞菌的关键酶并解析其对宿主代谢网络的影响
研究策略
在大肠杆菌TOP10中过表达运动发酵单胞菌的pdc和adhB基因（构建PET操纵子），通过发酵实验评估乙醇产量，并利用2-DE和LC-MS/MS进行差异蛋白质组学分析，揭示代谢网络重塑
核心内容
本研究在大肠杆菌TOP10中组装并过表达了来自运动发酵单胞菌的丙酮酸脱羧酶基因pdc和乙醇脱氢酶基因adhB构成的PET操纵子，以构建同型乙醇发酵通路。发酵实验显示，重组菌株pLPA102在5%葡萄糖条件下最大乙醇浓度达2.81%（v/v），产率为0.449 g乙醇/g糖，相当于理论最大值的88%；木糖和混合糖发酵亦分别达到2.11%和2.77%，而野生型仅产0.07%。结合2-DE和LC-MS/MS的差异蛋白质组学分析共鉴定出99个丰度差异蛋白点，其中46个下调、53个上调，并发现4个新诱导蛋白。TCA循环和甘油代谢等能量代谢相关蛋白上调，而糖酵解和乙醛酸循环蛋白下调，表明异源乙醇通路显著重塑了宿主全局代谢网络。该工作证明PDC和ADH过表达能大幅提升乙醇产量，但糖酵解的反馈抑制成为进一步提高产率的瓶颈，为后续通过解除糖酵解限制来优化大肠杆菌乙醇发酵性能指明了方向。
创新点
将运动发酵单胞菌的pdc和adhB组装成类似PET操纵子并转化大肠杆菌；利用蛋白质组学系统解析异源乙醇通路对宿主全局代谢网络的影响，发现糖酵解被抑制的新见解
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli TOP10 | 乙醇合成（同型乙醇发酵） | pdc | 丙酮酸脱羧酶（PDC） | 催化 | 来自运动发酵单胞菌，催化丙酮酸脱羧生成乙醛 |
| Escherichia coli TOP10 | 乙醇合成（同型乙醇发酵） | adhB | 乙醇脱氢酶II（ADH） | 催化 | 来自运动发酵单胞菌，催化乙醛还原为乙醇 |
| Escherichia coli TOP10 | 乙醇合成（PET操纵子） | pdc + adhB | PDC和ADH | 催化 | 携带在重组质粒pLPA102上，由pdc启动子和adhB终止子控制表达 |
关键发现
- 重组大肠杆菌(pLPA102)在5%葡萄糖发酵中获得最大乙醇浓度2.81%（v/v），乙醇产率0.449 g乙醇/g糖，为理论最大值的88%
- 5%木糖中最大乙醇浓度2.11%
- 3%葡萄糖+2%木糖混合糖中最大乙醇浓度2.77%
- 野生型大肠杆菌最大乙醇浓度仅0.07%。蛋白质组鉴定出99个差异丰度蛋白点，其中46个下调、53个上调，包括4个新诱导蛋白。TCA循环、甘油代谢等能量代谢蛋白上调，糖酵解和乙醛酸循环蛋白下调，表明代谢网络发生重塑
研究结论
过表达PDC和ADH显著提高了大肠杆菌的乙醇产量，但糖酵解途径被抑制是进一步提高产量的瓶颈，未来应通过最小化糖酵解抑制来优化代谢网络，以实现更高乙醇产率