Efficient hydroxylation of 1,8-cineole with monoterpenoid-resistant recombinant Pseudomonas putida GS1
- 作者
- Jia Mi, Hendrik Schewe, Markus Buchhaupt, Dirk Holtmann, Jens Schrader
- 杂志
- World Journal of Microbiology and Biotechnology（2016）
- DOI
- 10.1007/s11274-016-2071-y
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
单萜类化合物对微生物的毒性以及化学羟基化难以实现区域和立体选择性，导致(1R)-6β-羟基-1,8-桉叶素等高价值单萜衍生物难以经济生产。
研究策略
采用天然溶剂耐受菌Pseudomonas putida GS1作为底盘，异源表达来自Citrobacter braakii的细胞色素P450单加氧酶CYP176A1（P450cin）及其氧化还原伴侣CinC，通过全细胞催化实现1,8-桉叶素的高效立体选择性羟基化，并优化培养基和补料分批发酵工艺。
核心内容
针对单萜类底物对微生物的毒性和化学羟基化缺乏区域与立体选择性的问题，该研究以天然溶剂耐受菌Pseudomonas putida GS1为底盘，异源表达来自Citrobacter braakii的细胞色素P450单加氧酶CYP176A1（P450cin）及其天然氧化还原伴侣CinC，通过全细胞催化实现1,8-桉叶素的立体选择性羟基化。结果表明，GS1对1,8-桉叶素的耐受性显著优于大肠杆菌JM109，在10 mM底物下大肠杆菌生长明显受抑而GS1几乎不受影响；重组GS1在24 h内产生940 μM (1R)-6β-羟基-1,8-桉叶素，产量和P450cin含量均超过KT2440的两倍。在摇瓶中共表达CinC可使产物达到1.1 g/L，通过补料分批发酵优化，89 h内产量达13.3 g/L（78.2 mM），产率Y_p/s为79%，最高OD600达107.5。该产量是迄今报道的P450全细胞单萜羟基化最高水平，证明P. putida GS1可作为高效的单萜类化合物全细胞氧化生物催化剂平台，为高价值单萜衍生物的经济生产提供了可行策略。
创新点
1. 首次证明溶剂耐受性P. putida GS1可作为P450单加氧酶的高效异源表达宿主；2. 证明共表达天然氧化还原伴侣CinC能显著加速生物转化；3. 在生物反应器中获得迄今最高的P450全细胞单萜羟基化产量（13.3 g/L）；4. 证实P. putida GS1对1,8-桉叶素的耐受性优于E. coli和KT2440。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pseudomonas putida GS1 | 1,8-桉叶素羟基化 | cinA | CYP176A1 (P450cin) | 催化 | 异源表达的细胞色素P450单加氧酶，催化1,8-桉叶素区域和立体选择性羟基化生成(1R)-6β-羟基-1,8-桉叶素。 |
| Pseudomonas putida GS1 | 1,8-桉叶素羟基化 | cinC | Cinoxin (CinC) | 能量供给 | P450cin的天然FMN氧化还原伴侣蛋白，负责电子传递，共表达显著加速生物转化。 |
| Pseudomonas putida KT2440 | 1,8-桉叶素羟基化 | cinA | CYP176A1 (P450cin) | 催化 | 作为对照宿主，同样表达P450cin/CinC系统，但产物和蛋白量低于GS1。 |
| Pseudomonas putida KT2440 | 1,8-桉叶素羟基化 | cinC | Cinoxin (CinC) | 能量供给 | 与P450cin共表达于KT2440中，但效果不及GS1。 |
| Escherichia coli JM109 | 1,8-桉叶素羟基化 | cinA | CYP176A1 (P450cin) | 催化 | 用于生长抑制对比，并用于体外合成标准品。 |
| Escherichia coli JM109 | 1,8-桉叶素羟基化 | cinC | Cinoxin (CinC) | 能量供给 | 在E. coli中辅助P450cin进行体外合成。 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 1,8-桉叶素羟基化 | fpr | Ferredoxin reductase Fpr | 能量供给 | 用于体外合成(1R)-6β-羟基-1,8-桉叶素标准品，提供电子。 |
| Pseudomonas putida GS1 | 1,8-桉叶素羟基化 | cinB | CinB (还原酶) | 能量供给 | 原生还原酶，共表达未显著提高产物浓度。 |
关键发现
- ['在10 mM 1,8-桉叶素下，E. coli JM109生长明显受抑，而P. putida GS1和KT2440生长几乎不受影响
- 在20 mM时，KT2440的μmax降至对照的75.5±9.6%，GS1降至57.6±4.2%
- 在40 mM时分别降至68.3±11.4%和64.1±10.8%。', '重组P. putida GS1在24 h内产生940±33 μM (1R)-6β-羟基-1,8-桉叶素，而KT2440仅产生408±18 μM
- P450cin含量分别为0.098±0.01 μM和0.036±0.05 μM，GS1的产量和P450cin含量均超过KT2440的两倍。', '在摇瓶中，P. putida GS1共表达CinC在55 h内获得1.1±0.1 g/L产物
- 在TB培养基中，36 h内添加16 mM底物得到6.6±0.32 mM产物，对应产率Y_p/s为41% mol/mol。', '在补料分批生物反应器中，89 h内获得13.3±1.9 g/L (1R)-6β-羟基-1,8-桉叶素（78.2±10.9 mM），产率Y_p/s为79±11%，最高OD600达107.5±3.5（32.25±1.05 g cdw/L）。', '野生型P. putida GS1和KT2440均不能以1,8-桉叶素为唯一碳源生长，且不产生背景转化产物
- 野生型GS1在老化培养中可将(1R)-6β-羟基-1,8-桉叶素进一步氧化为6-氧代-1,8-桉叶素。']
研究结论
P. putida GS1被证明是高效的单萜类化合物全细胞氧化生物催化剂，通过异源表达P450cin/CinC系统，在生物反应器中实现了超过13 g/L的(1R)-6β-羟基-1,8-桉叶素产量，为迄今报道的基于P450的微生物单萜羟基化的最高产量，展示了该菌株作为单萜类化合物生产平台的巨大潜力。