De Novo Sequencing and Transcriptome Analysis of Wolfiporia cocos to Reveal Genes Related to Biosynthesis of Triterpenoids
- 作者
- Shaohua Shu, Bei Chen, Mengchun Zhou, Xinmei Zhao, Haiyang Xia, Mo Wang
- 单位
- College of Plant Science and Technology, Huazhong Agricultural University; Shanghai Institute of Plant Physiology and Ecology, Chinese Academy of Sciences
- 杂志
- PLoS ONE（2013）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0071350
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
揭示茯苓（Wolfiporia cocos）中三萜类化合物（尤其是茯苓酸）生物合成相关基因，填补其生物合成途径研究的空白。
研究策略
利用Illumina HiSeq 2000对茯苓菌丝体和菌核进行de novo转录组测序，组装与功能注释，结合差异表达分析、总三萜及茯苓酸含量测定和qRT-PCR验证，构建三萜生物合成途径。
核心内容
该研究首次对茯苓菌丝体和菌核进行de novo转录组测序，以揭示三萜类化合物生物合成相关基因。利用Illumina HiSeq 2000平台分别获得约3872万和3971万条高质量reads，组装后得到数万条contigs和singletons。差异表达分析显示菌丝体阶段有20242个基因上调，且总三萜含量（5.36%）和茯苓酸含量（0.458%）均显著高于菌核阶段（分别为1.43%和0.174%）。通过功能注释和qRT-PCR验证，研究构建了茯苓中完整的三萜生物合成途径，确认仅通过甲羟戊酸（MVA）途径进行，并鉴定了包括二磷酸甲羟戊酸脱羧酶、法尼基二磷酸合酶、羟甲基戊二酰CoA还原酶和羊毛甾醇合酶在内的关键候选基因，其中羟甲基戊二酰CoA还原酶和羊毛甾醇合酶在菌丝体中明显上调。研究还发现了可能参与茯苓酸生物合成的7-O-乙酰转移酶等候选基因。该工作填补了茯苓三萜生物合成途径研究的空白，为后续通过代谢工程提高茯苓酸产量及液态发酵生产奠定了基础。
创新点
首次完成茯苓的de novo转录组测序；提出茯苓中萜类生物合成仅通过MVA途径进行；鉴定出茯苓酸生物合成候选基因包括7-O-乙酰转移酶等。
研究对象（12）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Wolfiporia cocos | 三萜生物合成（MVA途径） | Unigene1133_All | acetyl-CoA C-acetyltransferase | 催化 | EC:2.3.1.9 |
| Wolfiporia cocos | 三萜生物合成（MVA途径） | Unigene7232_All | hydroxymethylglutaryl-CoA synthase | 催化 | EC:2.3.3.10 |
| Wolfiporia cocos | 三萜生物合成（MVA途径） | Unigene6395_All | hydroxymethylglutaryl-CoA reductase (NADPH) | 催化 | EC:1.1.1.34，菌丝体阶段上调 |
| Wolfiporia cocos | 三萜生物合成（MVA途径） | Unigene8508_All | mevalonate kinase | 催化 | EC:2.7.1.36 |
| Wolfiporia cocos | 三萜生物合成（MVA途径） | Unigene20430_All | diphosphomevalonate decarboxylase | 催化 | EC:4.1.1.33，菌丝体阶段上调 |
| Wolfiporia cocos | 三萜生物合成（MVA途径） | Unigene14106_All | farnesyl diphosphate synthase | 催化 | EC:2.5.1.1/2.5.1.10，菌丝体阶段上调 |
| Wolfiporia cocos | 三萜生物合成（MVA途径） | Unigene21656_All | farnesyl diphosphate synthase | 催化 | EC:2.5.1.1/2.5.1.10，菌丝体阶段上调 |
| Wolfiporia cocos | 三萜生物合成（MVA途径） | Unigene19472_All | farnesyl-diphosphate farnesyltransferase (squalene synthase) | 催化 | EC:2.5.1.21 |
| Wolfiporia cocos | 三萜生物合成（MVA途径） | Unigene11783_All | squalene monooxygenase | 催化 | EC:1.14.13.132 |
| Wolfiporia cocos | 三萜生物合成（MVA途径） | Unigene28001_All | lanosterol synthase | 催化 | EC:5.4.99.7，菌丝体阶段上调 |
| Wolfiporia cocos | 三萜生物合成（茯苓酸合成） | Unigene12366_All | salutaridinol 7-O-acetyltransferase (putative) | 催化 | 可能催化茯苓酸3位O-乙酰化，菌丝体阶段上调 |
| Wolfiporia cocos | 三萜生物合成（固醇代谢） | Unigene34077_All | cytochrome P450 family 51 (sterol 14-demethylase) | 催化 | EC:1.14.13.70 |
关键发现
- 菌丝体和菌核分别获得38,722,186和39,710,244条高质量reads，总碱基数分别为3,484,996,740 bp和3,573,921,960 bp
- 组装得到菌丝体60,354条contigs和40,939个singletons，菌核56,938条contigs和37,220个singletons
- 总三萜含量在菌丝体和菌核中分别为5.36%和1.43%，茯苓酸含量分别为0.458%和0.174%
- 菌丝体阶段20,242个基因上调，菌核阶段15,970个
- qRT-PCR证实编码二磷酸甲羟戊酸脱羧酶（Unigene20430）、法尼基二磷酸合酶（Unigene14106和21656）、羟甲基戊二酰CoA还原酶（Unigene6395_All）和羊毛甾醇合酶（Unigene28001_All）的unigenes在菌丝体阶段上调。
研究结论
茯苓中三萜生物合成通过MVA途径，菌丝体阶段相关基因高表达并积累更多三萜，研究为茯苓三萜代谢工程和液态发酵生产奠定了基础。