Agrobacterium Mediated Transient Gene Silencing (AMTS) in Stevia rebaudiana: Insights into Steviol Glycoside Biosynthesis Pathway
- 作者
- Praveen Guleria, Sudesh Kumar Yadav
- 单位
- CSIR- Institute of Himalayan Bioresource Technology, Palampur, Himachal Pradesh, India
- 杂志
- PLoS ONE（2013）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0074731
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
甜菊糖苷生物合成途径的遗传调控机制尚不清楚，特别是与赤霉素生物合成的关系。
研究策略
采用RNAi介导的农杆菌瞬时基因沉默（AMTS）技术，通过注射农杆菌浸润甜菊叶片，沉默SrKA13H和三个UDP糖基转移酶基因（SrUGT85C2、SrUGT74G1、SrUGT76G1），利用半定量PCR检测基因表达、HPLC测定甜菊糖苷和GA3含量，并结合分子对接预测蛋白与底物的结合亲和力。
核心内容
该研究利用农杆菌介导的瞬时基因沉默（AMTS）技术，在甜菊叶片中分别沉默SrKA13H及三个UDP糖基转移酶基因，以解析甜菊糖苷生物合成途径及其与赤霉素代谢的碳流分配关系。通过半定量PCR确认靶基因表达显著降低，HPLC测定显示沉默SrKA13H使总甜菊糖苷含量下降36%–40%，同时GA3增加11%–15%；沉默SrUGT85C2使甜菊糖苷减少22%–58%，GA3增加21%–34%；沉默SrUGT74G1和SrUGT76G1则分别使糖苷含量降低40%–46%和56%–63%，后者对GA3影响甚微。分子对接显示SrUGT76G1对底物19-O-β-glucopyranosyl steviol的结合能最低（-7.11 kCal/mol），解释了其沉默后糖苷下降最显著的现象。结果表明SrKA13H与SrUGT85C2是控制碳流向甜菊糖苷或赤霉素分支的关键节点，沉默它们可将代谢流导向赤霉素合成；同时实验证据支持存在不依赖SrUGT76G1的替代糖苷合成途径。该工作首次在甜菊中应用AMTS技术，为通路调控提供了快速体内验证手段。
创新点
首次在甜菊中应用AMTS技术研究甜菊糖苷生物合成途径；鉴定出SrKA13H和SrUGT85C2为调控甜菊糖苷与赤霉素间碳流分配的关键基因；提供了体内证据表明存在替代的甜菊糖苷生物合成途径。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Stevia rebaudiana 叶片 | 甜菊糖苷生物合成途径 | SrKA13H | ent-kaurenoic acid-13 hydroxylase | 催化 | 编码贝壳杉烯酸-13羟化酶，沉默后表达降低74%-86%，甜菊糖苷含量减少36%-40%，GA3含量增加11%-15% |
| Stevia rebaudiana 叶片 | 甜菊糖苷生物合成途径 | SrUGT85C2 | UDP糖基转移酶85C2 | 催化 | 沉默后表达降低79%-99%，甜菊糖苷含量减少22%-58%，GA3含量增加21%-34%，与SrKA13H共同调控碳流 |
| Stevia rebaudiana 叶片 | 甜菊糖苷生物合成途径 | SrUGT74G1 | UDP糖基转移酶74G1 | 催化 | 沉默后表达降低59%-92%，甜菊糖苷含量减少40%-46%，GA3含量变化较小 |
| Stevia rebaudiana 叶片 | 甜菊糖苷生物合成途径 | SrUGT76G1 | UDP糖基转移酶76G1 | 催化 | 沉默后表达降低63%-84%，甜菊糖苷含量减少56%-63%（下降最多），GA3仅增加4%，对19-O-β-glucopyranosyl steviol和rubusoside具有最高亲和力，可能参与替代途径 |
关键发现
- 沉默SrKA13H使靶基因表达降低74%-86%，总甜菊糖苷含量下降36%-40%，GA3含量增加11%-15%
- 沉默SrUGT85C2使靶基因表达降低79%-99%，甜菊糖苷含量减少22%-58%，GA3含量增加21%-34%
- 沉默SrUGT74G1使靶基因表达降低59%-92%，甜菊糖苷含量减少40%-46%
- 沉默SrUGT76G1使靶基因表达降低63%-84%，甜菊糖苷含量减少56%-63%，GA3含量仅增加4%。分子对接显示SrUGT76G1对19-O-β-glucopyranosyl steviol和rubusoside的结合能分别为-7.11和-4.79 kCal/mol，为三者中最低，表明其亲和力最高，这是沉默SrUGT76G1后甜菊糖苷含量下降最显著的原因。
研究结论
SrKA13H和SrUGT85C2是调控甜菊糖苷与赤霉素生物合成之间碳流的关键基因，沉默它们会将代谢流从甜菊糖苷途径转向赤霉素途径；同时研究证实了存在替代的甜菊糖苷生物合成途径，SrUGT76G1可能参与该替代途径。