高级醇 · 代谢工程文献库

← 返回列表

Optimal Expression Condition of Recombinant RAP

作者
ZHANG Jie, ZHANG Hong, BI Hao, LIU Zhiguo, GUO Jianli, QU Shen
单位
Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Basic Medical Sciences, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China; Department of Biotechnology and Chemical Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China
杂志
Journal of Huazhong University of Science and Technology [Medical Sciences]（2007）
DOI
10.1007/s11596-007-0102-5
所属领域
发酵工程
关键词
induced expressionpurificationreceptor associated protein
阅读原文
查看 PDF 原文

解决的核心问题

优化人受体相关蛋白（RAP）在大肠杆菌中的重组表达条件，解决表达量低、可溶性差、纯化困难及活性验证不足等问题，以获取具有生物学功能的高纯度RAP蛋白作为研究工具。

研究策略

构建pT7-PL-RAP和pET-28a(+)-RAP两种原核表达载体，转化不同大肠杆菌宿主（BL21(DE3)与BL21(DE3, plysS)），比较IPTG诱导条件下氯霉素、诱导时间等因素对RAP表达量和可溶性的影响；利用Ni2+-NTA亲和层析纯化融合蛋白，并通过FITC标记后与RAW264.7细胞的结合实验验证其生物学活性。

研究路线图

100%
问题：RAP重组表达量低、可溶性差、纯化难、活性验证不足
策略：构建两种表达载体，筛选宿主与诱导条件
载体构建：pT7-PL-RAP 与 pET-28a(+)-RAP
宿主筛选：BL21(DE3) 与 BL21(DE3,pLysS) 对比
关键改造：添加氯霉素 + 诱导时间延至16h
结果：表达量达总蛋白76%，可溶性显著提升
纯化：Ni2+-NTA亲和层析获得SDS-PAGE单一条带
活性验证：FITC标记结合RAW264.7细胞呈阳性
结论：建立高表达可溶性RAP工艺，可用于LDLR家族疾病研究
Text is not SVG - cannot display

下载 .drawio 源文件

核心内容

为获取具有生物学功能的高纯度人受体相关蛋白（RAP），本研究构建了pT7-PL-RAP和pET-28a(+)-RAP两种原核表达载体，转化至BL21(DE3)及BL21(DE3, plysS)宿主菌中，系统考察了氯霉素、诱导时间等因素对重组蛋白表达量及可溶性的影响。结果显示，在BL21(DE3, plysS)中pT7-PL-RAP表达量显著高于BL21(DE3)，添加氯霉素可增强IPTG诱导表达，而将诱导时间延长至16小时可同时提升表达水平和可溶性。优化后RAP表达量可达细菌总蛋白的76%，经Ni²⁺-NTA亲和纯化后获得SDS-PAGE级别单一条带，每毫升菌液约可得10 μg纯化蛋白。FITC标记的纯化RAP能与富含LDLR家族的RAW264.7细胞强结合，而不与缺乏相关受体的Ldl-A7细胞结合，证实其具备天然生物活性。该研究建立了高效可溶的人RAP大肠杆菌表达纯化工艺，为阿尔茨海默病等LDLR家族相关疾病研究提供了可行的工具蛋白制备方案。

创新点

系统筛选并优化了RAP在大肠杆菌中的表达条件，发现氯霉素可显著提高pT7-PL-RAP在BL21(DE3, plysS)中的诱导表达；延长诱导时间至16 h可同时提高表达水平和可溶性；建立了表达量达细菌总蛋白76%的高效可溶性表达体系，并获得了纯度达SDS-PAGE级别、具有受体结合活性的功能性RAP。

研究对象（3）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
E. coli BL21(DE3, plysS) 人RAP重组蛋白异源表达 RAP 人受体相关蛋白（RAP） 调控 使用pT7-PL-RAP载体；含氯霉素筛选可提高表达；诱导16 h表达量显著高于5 h，表达量占细菌总蛋白76%。
E. coli BL21(DE3) 人RAP重组蛋白异源表达 RAP 人受体相关蛋白（RAP） 调控 使用pET-28a(+)-RAP载体；表达蛋白约43 kD；经Ni-NTA纯化后每毫升菌液可得约10 μg纯化RAP。
RAW264.7（小鼠巨噬细胞） LDLR家族结合通路 无（内源性受体） LDLR、LRP、VLDLR 转运 用于验证纯化RAP的生物学活性，阳性结合；Ldl-A7细胞为阴性对照。

关键发现

  1. 两种表达载体均实现RAP高表达，分子量分别约40 kD（pT7-PL-RAP）和43 kD（pET-28a(+)-RAP）
  2. 在BL21(DE3, plysS)中pT7-PL-RAP的表达量显著高于BL21(DE3)
  3. 加入氯霉素可提高IPTG诱导的RAP表达，而去除氯霉素则降低诱导表达
  4. 诱导16 h的表达量显著高于5 h，且大部分RAP以可溶形式存在于上清中
  5. 优化后RAP产量达到细菌总蛋白的76%
  6. 经Ni2+-NTA纯化后得到SDS-PAGE单一条带，每毫升菌液可获得约10 μg纯化RAP
  7. FITC标记的纯化RAP能与富含LDLR家族的RAW264.7细胞强结合，而不能与缺乏LRP/VLDLR的Ldl-A7细胞结合，证明其具有生物活性。

研究结论

通过优化表达载体、宿主菌、氯霉素选择和诱导时间，成功建立了人RAP在大肠杆菌中高表达、高纯度的可溶性表达工艺，所得RAP蛋白具有与天然蛋白一致的生物学功能，可作为LDLR家族相关疾病（如阿尔茨海默病）研究的有效工具和制备基础。