Screening and breeding of high taxol producing fungi by genome shuffling
- 作者
- ZHAO Kai, PING WenXiang, ZHANG LiNa, LIU Jun, LIN Yan, JIN Tao, ZHOU DongPo
- 单位
- Laboratory of Microbiology, College of Life Science, Heilongjiang University, Harbin 150080, China
- 杂志
- Science in China Series C: Life Sciences（2008）
- DOI
- 10.1007/s11427-008-0037-5
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
紫杉醇产生菌产量低，难以满足工业化生产需求，需开发高效的菌种选育方法以提高紫杉醇产量。
研究策略
以Nodulisporium sylviforme为出发菌株，采用基因组改组技术，通过多亲本原生质体融合和多轮重组，结合制霉菌素抗性筛选及发酵产物TLC/HPLC/LC-MS分析，选育高产紫杉醇菌株。
核心内容
以紫杉醇产生菌Nodulisporium sylviforme为对象，针对其产量低、难以满足工业化需求的问题，研究采用基因组改组技术进行菌种选育。通过热灭活、UV及UV+LiCl不同方式处理亲本原生质体以避免同一位点损伤，结合制霉菌素抗性筛选压力，经四轮多亲本原生质体融合与重组，获得三株遗传稳定的高产菌株F4-17、F4-26和F4-70，其紫杉醇产量分别为487.93、516.37和496.74 μg/L。其中最优菌株F4-26的产量较起始菌株NCEU-1（314.07 μg/L）提高64.41%，较亲本菌株（356.80–392.63 μg/L）提高31.52%–44.72%。融合条件优化为35% PEG6000、90 s融合时间及0.01 mol/L CaCl2，融合率由(12.8±0.6)%提升至(15.4±0.7)%，LC-MS确认产物为紫杉醇（[M+H]+ m/z 854.92）。结果表明基因组改组能显著提升紫杉醇产量且菌株遗传稳定，为微生物发酵生产紫杉醇提供了优良菌株，并首次验证了该技术在真菌育种中的有效性。
创新点
首次将基因组改组应用于紫杉醇产生菌育种；采用不同灭活方法（热灭活、UV、UV+LiCl）处理不同亲本原生质体，避免同一位点损伤；利用制霉菌素抗性作为筛选压力提高筛选效率。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Nodulisporium sylviforme NCEU-1 | 紫杉醇生物合成 | — | — | 催化 | 经多轮诱变筛选获得的起始出发菌株，紫杉醇产量314.07 μg/L |
| Nodulisporium sylviforme HD100-23, UV40-19, UL50-6 | 紫杉醇生物合成 | — | — | 催化 | 第一轮基因组改组的三个亲本菌株，紫杉醇产量分别为356.80、376.38、392.63 μg/L |
| Nodulisporium sylviforme F4-26 | 紫杉醇生物合成 | — | — | 催化 | 经四轮基因组改组获得的高产菌株，紫杉醇产量516.37 μg/L，比亲本提高31.52%-44.72% |
关键发现
- 经四轮基因组改组获得三株遗传稳定的高产紫杉醇菌株F4-17、F4-26和F4-70，产量分别为487.93、516.37和496.74 μg/L
- 其中F4-26产量为516.37 μg/L，比起始菌株NCEU-1（314.07 μg/L）高64.41%，比亲本菌株（356.80-392.63 μg/L）高31.52%-44.72%
- 优化融合条件为35% PEG6000、90 s融合时间、0.01 mol/L CaCl2，融合率从(12.8±0.6)%提高至(15.4±0.7)%
- LC-MS确认产物为紫杉醇（[M+H]+ m/z 854.92）。
研究结论
基因组改组可显著提高紫杉醇产生菌的产量，获得的高产菌株遗传稳定，为紫杉醇的微生物发酵生产提供优良菌株，并首次证明了该技术在真菌育种中的有效性。