A Trichome-Specific Linoleate Lipoxygenase Expressed During Pyrethrin Biosynthesis in Pyrethrum
- 作者
- Aldana M. Ramirez, Ting Yang, Harro J. Bouwmeester, Maarten A. Jongsma
- 单位
- Plant Research International, Wageningen University and Research Centre, Wageningen, The Netherlands; Laboratory of Plant Physiology, Wageningen University, Wageningen, The Netherlands; Laboratory of Entomology, Wageningen University, Wageningen, The Netherlands
- 杂志
- Lipids（2013）
- DOI
- 10.1007/s11745-013-3815-1
- 所属领域
- 植物代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
鉴定并克隆除虫菊中参与除虫菊酯生物合成醇部分第一步（亚麻酸13位氢过氧化）的脂氧合酶基因，并验证其功能和表达特征。
研究策略
基于EST文库筛选25个脂氧合酶候选基因，利用RTqPCR比较其与TcCDS的表达模式，选择相似基因进行RACE克隆全长cDNA，在大肠杆菌中异源表达并测定酶催化活性，通过系统发育分析和组织表达分析验证其功能。
研究路线图
核心内容
该研究从除虫菊中鉴定并克隆了两个毛状体特异性表达的13-脂氧合酶基因TcLOX1和TcLOX2，旨在阐明除虫菊酯生物合成中醇部分第一步（亚麻酸13位氢过氧化）的催化酶。研究者基于EST文库筛选25个候选基因，通过RT-qPCR比较其与TcCDS的表达模式，选择表达相似的基因进行RACE克隆，并在大肠杆菌中异源表达测定活性。结果显示TcLOX1 cDNA全长2724 bp，编码907个氨基酸，重组蛋白能催化亚麻酸生成13-氢过氧化物，产物与13-HPOT标准品共洗脱；TcLOX2虽同样属于13-LOX且毛状体高表达，但体外未检测到活性。表达分析表明TcLOX1与TcCDS模式一致，在毛状体中高表达，花发育早期中等表达，后期降至5%以下。该结果首次提供了TcLOX1催化除虫菊酯醇部分第一步的酶学证据，为完整解析除虫菊酯生物合成途径及组织特异性分工奠定基础。
创新点
首次从除虫菊中克隆了毛状体特异性表达的13-脂氧合酶TcLOX1和TcLOX2，并证实TcLOX1能在体外催化亚麻酸13位氢过氧化，为阐明除虫菊酯醇部分生物合成途径提供关键酶学证据。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL-21 | 除虫菊酯生物合成/oxylipin途径 | TcLOX1 | TcLOX1 (linoleate lipoxygenase) | 催化 | 重组表达后催化亚麻酸13位氢过氧化生成13-HPOT；毛状体特异性表达，叶绿体定位 |
| Escherichia coli BL-21 | 除虫菊酯生物合成/oxylipin途径 | TcLOX2 | TcLOX2 (lipoxygenase) | 催化 | 重组表达但未检测到酶活性；同样毛状体高表达，叶绿体定位，功能未知 |
| Tanacetum cinerariifolium | 除虫菊酯酸部分生物合成（萜类合成） | TcCDS | Chrysanthemyl diphosphate synthase | 催化 | 编码菊酰焦磷酸合酶，催化除虫菊酸部分第一步；作为表达模式对照 |
| Tanacetum cinerariifolium | 除虫菊酯生物合成（酯化反应） | TcGLIP | GDSL-like lipase | 催化 | 负责将酸部分与醇部分酯化生成除虫菊酯；在果皮/子房中表达 |
关键发现
- 克隆到两种脂氧合酶：TcLOX1 cDNA全长2724 bp，编码907个氨基酸，预测分子量102.5 kDa，pI 7.2
- TcLOX2 cDNA全长2700 bp，编码899个氨基酸。系统进化分析显示TcLOX1与马铃薯StLOX3.1相似性为75%，TcLOX2与StLOX2.1相似性为60%，TcLOX1与TcLOX2之间相似性仅40%。重组TcLOX1在大肠杆菌中表达后能催化亚麻酸生成13-氢过氧化物，产物与13-HPOT标准品共洗脱
- TcLOX2在相同条件下未检测到活性。表达分析表明TcLOX1与TcCDS表达模式一致：在毛状体中高表达，在花发育早期（2-5期）中等表达，后期（6-7期）显著降低（<5%），在无腺毛的幼苗中不表达。25个LOX EST候选中有6个呈现TcCDS样表达模式，其中Ct938相对TcCDS表达量为56%，Ct20675为32%，Ct425为18%，Ct4895为12%，Ct20982为9.2%，Ct2442为7.9%。
研究结论
TcLOX1是一种毛状体特异性、叶绿体定位的13-脂氧合酶，很可能催化除虫菊酯醇部分生物合成的第一步；TcLOX2虽同样属于13-LOX且毛状体高表达，但体外无活性，其生理功能及是否参与除虫菊酯合成仍需进一步研究。该结果为完整解析除虫菊酯生物合成途径及组织特异性分工提供了重要基础。