3-Methyl-1-butanol Biosynthesis in an Engineered Corynebacterium glutamicum
- 作者
- Shiyuan Xiao, Jingliang Xu, Xiaoyan Chen, Xiekun Li, Yu Zhang, Zhenhong Yuan
- 杂志
- Molecular Biotechnology（2016）
- DOI
- 10.1007/s12033-016-9929-y
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在谷氨酸棒杆菌中实现3-甲基-1-丁醇的生物合成，解决高级醇对细胞毒性以及丙酮酸代谢竞争途径削弱碳流的问题。
研究策略
在C. glutamicum中过表达来自乳酸乳球菌的α-酮异戊酸脱羧酶基因kivd（添加核糖体结合位点RBS优化表达），并分别组合来自酿酒酵母、乳酸乳球菌和运动发酵单胞菌的乙醇脱氢酶基因adh2、adhA、adh3，筛选最优组合；进一步敲除丙酮酸脱氢酶复合物E1亚基基因aceE和乳酸脱氢酶基因ldh，阻断竞争途径以增强碳通量。
核心内容
该研究在谷氨酸棒杆菌中构建了3-甲基-1-丁醇的生物合成途径，以期缓解高级醇细胞毒性并解决丙酮酸代谢竞争导致的碳流损失问题。研究者过表达了来自乳酸乳球菌的α-酮异戊酸脱羧酶基因kivd，并通过添加核糖体结合位点优化其表达，使异戊醛产量从极低水平提升至0.063 g/L。在此基础上，分别组合来自酿酒酵母、乳酸乳球菌和运动发酵单胞菌的三种乙醇脱氢酶基因adh2、adhA、adh3，发现仅adh3能高效将异戊醛还原为3-甲基-1-丁醇，重组菌C6发酵12小时产3-甲基-1-丁醇0.182 g/L、异丁醇0.144 g/L，而adh2和adhA组合则几乎不产目标醇。进一步敲除丙酮酸脱氢酶复合物E1亚基基因aceE后，菌株C12的3-甲基-1-丁醇产量达0.497 g/L，较原始菌提高2.7倍；额外敲除乳酸脱氢酶基因ldh的C13菌株虽使异丁醇升至0.336 g/L，但目标醇产量未再增加，说明ldh缺失有助于碳流向α-酮酸但对3-甲基-1-丁醇合成贡献有限。该工作首次验证了运动发酵单胞菌adh3在谷氨酸棒杆菌中对异戊醛还原的偏好性，并最终获得0.497 g/L的3-甲基-1-丁醇产量，为当时该菌中报道的最高水平，证明通过表达外源脱羧酶与脱氢酶并结合竞争途径弱化，可在谷氨酸棒杆菌中实现支链高级醇的过量生产。
创新点
['首次在C. glutamicum中验证来自运动发酵单胞菌的adh3对异戊醛还原为3-甲基-1-丁醇具有最佳偏好性', '通过RBS优化kivd表达，显著增强异戊醛合成', '敲除aceE单基因使3-甲基-1-丁醇产量提高2.7倍']
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Corynebacterium glutamicum ATCC13032 | 3-甲基-1-丁醇非发酵合成途径 | kivd | α-酮异戊酸脱羧酶 | 催化 | 来自Lactococcus lactis IFPL730，催化α-酮异己酸脱羧生成异戊醛；添加RBS增强表达 |
| Corynebacterium glutamicum ATCC13032 | 3-甲基-1-丁醇非发酵合成途径 | adh3 | 乙醇脱氢酶3 | 催化 | 来自Zymomonas mobilis UQM410，对异戊醛还原为3-甲基-1-丁醇具有最佳活性 |
| Corynebacterium glutamicum ATCC13032 | 3-甲基-1-丁醇非发酵合成途径 | adh2 | 乙醇脱氢酶2 | 催化 | 来自Saccharomyces cerevisiae S288C，对乙醛活性最高，对异戊醛还原能力弱，未能生产3-甲基-1-丁醇 |
| Corynebacterium glutamicum ATCC13032 | 3-甲基-1-丁醇非发酵合成途径 | adhA | 乙醇脱氢酶A | 催化 | 来自Lactococcus lactis IFPL730，偏好异丁醛还原，对异戊醛还原能力接近野生型 |
| Corynebacterium glutamicum ATCC13032 | 丙酮酸代谢 | aceE | 丙酮酸脱氢酶复合物E1亚基 | 催化 | 敲除该基因减少乙酰辅酶A竞争，使3-甲基-1-丁醇产量提高2.7倍 |
| Corynebacterium glutamicum ATCC13032 | 乳酸发酵 | ldh | 乳酸脱氢酶 | 催化 | 敲除该基因减少乳酸竞争，但未进一步提高3-甲基-1-丁醇，反而增加异丁醇产量 |
关键发现
- 单独表达kivd时异戊醛产量极低，添加RBS后异戊醛达0.063 g/L。重组菌C6（kivd-rbs+adh3）发酵12 h产3-甲基-1-丁醇0.182 g/L、异丁醇0.144 g/L
- C5（kivd-rbs+adhA）产异丁醇0.81 g/L但检测不到3-甲基-1-丁醇
- C4（kivd-rbs+adh2）不产3-甲基-1-丁醇且异戊醛降至0.028 g/L。敲除aceE的C12菌株产3-甲基-1-丁醇0.497 g/L，异丁醇0.287 g/L，产量较原始菌提高2.7倍
- 进一步敲除ldh的C13菌株产3-甲基-1-丁醇0.482 g/L，异丁醇0.336 g/L，说明ldh缺失有助于碳流向α-酮酸，但未进一步提高3-甲基-1-丁醇。蛋白含量测定显示C1为0.209 mg/mL，C7（adh2）为0.333 mg/mL，C8（adhA）为0.336 mg/mL，C9（adh3）为0.295 mg/mL。
研究结论
通过过表达kivd和adh3并敲除aceE和ldh，成功在C. glutamicum中实现3-甲基-1-丁醇的过量生产，最佳重组菌C12在LBG培养基中发酵12 h可产0.497 g/L 3-甲基-1-丁醇，为当时C. glutamicum中报道的最高产量。