Statistical Screening of Medium Components for Recombinant Production of Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 Rhamnolipids by Nonpathogenic Cell Factory Pseudomonas putida KT2440

作者: Payam Setoodeh, Abdolhossein Jahanmiri, Reza Eslamloueyan, Ali Niazi, Seyyed Shahaboddin Ayatollahi, Farzaneh Aram, Maziyar Mahmoodi, Ali Hortamani
单位: School of Chemical and Petroleum Engineering, Shiraz University; Institute of Biotechnology, Shiraz University; EOR Research Center, Shiraz University; Sharif University of Technology
杂志: Applied Biochemistry and Biotechnology（2013）
DOI: 10.1007/s12033-013-9693-1
所属领域: 代谢工程
关键词: Experimental screening designHeterologous rhamnolipids productionPseudomonas aeruginosa ATCC 9027Pseudomonas putida KT2440TransformationTwo-level factorial design
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解决的核心问题

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是机会性人类病原体，其产生的鼠李糖脂（RLs）具有商业价值，但大规模生产受限于菌株安全性。本研究旨在利用非致病性恶臭假单胞菌KT2440作为底盘细胞，异源表达铜绿假单胞菌ATCC 9027的rhlAB基因，并通过统计学实验设计筛选关键培养基组分，以优化重组鼠李糖脂的生产。

研究策略

从单鼠李糖脂产生菌P. aeruginosa ATCC 9027中克隆rhlAB基因，构建pVLT33-rhlAB载体并转化至非致病性宿主P. putida KT2440；利用两步筛选设计（二水平部分因子设计分辨率IV + 二水平全因子设计）考察碳源、氮源和磷酸盐等8种宏观营养因子对重组菌RLs产量的影响，并通过方差分析和半正态图确定显著因子及其交互作用。

研究路线图

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核心内容

本研究从单鼠李糖脂产生菌铜绿假单胞菌ATCC 9027中克隆rhlAB基因，构建pVLT33-rhlAB载体并转化至非致病性恶臭假单胞菌KT2440，实现鼠李糖脂的异源合成。采用两步筛选设计（二水平部分因子设计分辨率IV及全因子设计），考察碳源、氮源和磷酸盐等8种营养因子对重组菌鼠李糖脂产量的影响。结果显示，重组菌在LB培养基中经IPTG诱导可产生222~247 mg/L鼠李糖脂，添加20 g/L葡萄糖后产量提高至425~468 mg/L；筛选实验中最高产量约570 mg/L。方差分析表明甘油、酵母提取物和蛋白胨为显著正效应因子，贡献率分别为64.55%、20.85%和7.33%，但酵母提取物/蛋白胨及甘油/酵母提取物/蛋白胨交互呈显著负效应，提示生物量与产物形成之间存在权衡。该研究证实非致病性恶臭假单胞菌KT2440可作为安全底盘生产鼠李糖脂，两步筛选设计以较少实验识别了关键培养基组分及其交互作用，为后续混料设计和过程优化奠定了实验基础。

创新点

['首次从P. aeruginosa ATCC 9027（单鼠李糖脂产生菌）克隆rhlAB基因并在P. putida KT2440中异源表达', '采用两步筛选设计（部分因子+全因子）以最少实验次数识别关键培养基组分及二/三因子交互作用', '评估了复合培养基、矿物质培养基、双阶段培养及混合培养基等多种培养方式对RLs生产的影响', '通过IPTG诱导实现rhlAB表达，规避了铜绿假单胞菌中复杂的群体感应调控系统']

研究对象（5）

底盘细胞	代谢通路	基因	蛋白	功能	说明
Pseudomonas putida KT2440	鼠李糖脂生物合成途径	rhlA	RhlA（鼠李糖基转移酶A）	催化	负责缩合两个β-羟基脂肪酸形成HAA前体
Pseudomonas putida KT2440	鼠李糖脂生物合成途径	rhlB	RhlB（鼠李糖基转移酶B）	催化	催化dTDP-L-鼠李糖与HAA缩合形成单鼠李糖脂
Escherichia coli BL21DE3	质粒维持与克隆	—	—	调控	用于pVLT33-rhlAB质粒的克隆与扩增
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027	鼠李糖脂生物合成途径	rhlAB	RhlA/RhlB	催化	rhlAB基因来源菌株，为单鼠李糖脂产生菌，其产物中分子量504的鼠李糖脂约占82%
Pseudomonas putida KT2440	鼠李糖脂异源合成	rhlAB	RhlA/RhlB	催化	通过pVLT33载体在IPTG诱导下表达，实现鼠李糖脂异源生产

关键发现

重组P. putida KT2440(pVLT33-rhlAB)在LB培养基中产生222~247 mg/L RLs（IPTG 0.4~1.2 mM）
添加20 g/L葡萄糖后RLs产量提高至425~468 mg/L，且IPTG浓度从0.4提高至1.2 mM使产量增加约10%
在混合培养基（LB+矿物质溶液1+甘油）中产量为234 mg/L，双阶段培养为157 mg/L。初始筛选中RLs产量从0变化到565 mg/L（培养基12号），全因子筛选中最高产量约570 mg/L（培养基8号）。甘油、酵母提取物和蛋白胨对RLs产生有显著正效应，贡献率分别为64.55%、20.85%和7.33%
酵母提取物/蛋白胨二因子交互及甘油/酵母提取物/蛋白胨三因子交互具有显著负效应
甘油/酵母提取物和甘油/蛋白胨二因子交互为正效应。数学模型的R²分别为0.9902（第一轮）和0.9893（第二轮）。

研究结论

本研究证实了非致病性P. putida KT2440可作为异源生产铜绿假单胞菌鼠李糖脂的安全底盘，重组菌能够产生单鼠李糖脂。甘油、酵母提取物和蛋白胨是影响RLs产量的关键阳性因素，但其交互作用（酵母提取物/蛋白胨、甘油/酵母提取物/蛋白胨）呈负效应，提示存在生物量与产物形成之间的权衡。两步筛选设计能以较少实验获得关键信息，为进一步的培养基优化（如混料设计）和高细胞密度培养研究奠定基础。