Identification and Characterization of a Ginsenoside-Transforming β-Glucosidase from Pseudonocardia sp. Gsoil 1536 and Its Application for Enhanced Production of Minor Ginsenoside Rg2(S)
- 作者
- Juan Du, Chang-Hao Cui, Sung Chul Park, Jin-Kwang Kim, Hong-Shan Yu, Feng-Xie Jin, Changkai Sun, Sun-Chang Kim, Wan-Taek Im
- 单位
- KAIST Institute for Biocentury, Korea Advanced Institute of Science and Technology; College of Biotechnology, Dalian Polytechnic University; Department of Biological Sciences, Korea Advanced Institute of Science and Technology; Intelligent Synthetic Biology Center; Institute for Brain Disorders, Dalian Medical University; Department of Biotechnology, Hankyoung National University
- 杂志
- PLoS ONE（2014）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0096914
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
人参皂苷 Rg2(S) 在天然人参中含量极低（红参中不足干重的0.02%），且传统热酸处理易产生副产物，缺乏高效、高选择性的大规模制备方法。
研究策略
从可水解人参皂苷的菌株 Pseudonocardia sp. Gsoil 1536 中克隆 GH3 家族 β-葡萄糖苷酶基因 bglPC28，在大肠杆菌 BL21(DE3) 中异源表达获得重组酶，利用该酶将主要人参皂苷 Re 特异性转化为稀有人参皂苷 Rg2(S)，优化反应条件后放大至100克级。
核心内容
从可水解人参皂苷的菌株Pseudonocardia sp. Gsoil 1536中克隆了GH3家族β-葡萄糖苷酶基因bglPC28，该基因长2232 bp，编码743个氨基酸。将重组酶在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达后，发现其最适pH为7.0、最适温度为37°C，对底物人参皂苷Re的Km为1.42±0.13 mM，Vmax为5.62±0.21 μmol min⁻¹ mg⁻¹。该酶可将主要人参皂苷Re特异性转化为稀有人参皂苷Rg2(S)，同时也能将Rb1/Rd转化为Rg3(S)，将Rg1转化为Rh1(S)。在10 L生物反应器中，以20 mg/mL Re（总量150 g）为底物，在30°C、pH 7.0、含10% DMSO条件下反应24 h，经HP20树脂纯化获得113 g Rg2(S)，色谱纯度达84.0±1.1%，摩尔回收率高达87.1%。这一酶法生物转化体系实现了100克级高纯度Rg2(S)的高效制备，克服了天然提取法产率低和传统热酸处理易产生副产物的缺陷，为化妆品、功能食品和制药行业提供了切实可行的工业化生产途径。
创新点
['首次报道利用重组糖苷水解酶实现100克级高纯度人参皂苷 Rg2(S) 的生产', '新鉴定了来自 Pseudonocardia sp. Gsoil 1536 的 GH3 家族 β-葡萄糖苷酶 BglPC28，能高效转化 Re 为 Rg2(S)', '实现了简单纯化工艺，克服了已有方法产率低、纯化复杂的问题']
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 人参皂苷生物转化（Re→Rg2(S)） | bglPC28 | BglPC28（GH3家族β-葡萄糖苷酶） | 催化 | 异源表达宿主，使用GST融合pGEX 4T-1载体系统生产重组酶 |
| Pseudonocardia sp. Gsoil 1536 | 人参皂苷生物转化（Re→Rg2(S)） | bglPC28 | BglPC28 | 催化 | 酶基因来源菌株，可转化Re和Rg1 |
关键发现
- 基因 bglPC28 长2232 bp，编码743个氨基酸，预测分子量78975 Da；重组酶最适 pH
- 0、温度37°C；底物 pNPG 和 Re 的 Km 分别为
- 36±1.10 mM 和
- 42±0.13 mM，Vmax 分别为
- 0±2.55 和
- 62±0.21 μmol min^-1 mg^-1；在10 L生物反应器中，以20 mg/mL Re（总量150 g）为底物，30°C、pH
- 0、含10% DMSO 条件下反应24 h，经HP20树脂纯化获得113 g Rg2(S)，色谱纯度84.0±1.1%，摩尔回收率87.1%。此外，BglPC28 还能将 Rb1/Rd 转化为 Rg3(S)，将 Rg1 转化为 Rh1(S)。
研究结论
所构建的酶法生物转化体系可高效、大规模地从人参皂苷 Re 制备高纯度稀有人参皂苷 Rg2(S)，为化妆品、功能食品和制药行业提供了切实可行的工业化生产途径。