Studies on the Expression of Sesquiterpene Synthases Using Promoter-β-Glucuronidase Fusions in Transgenic Artemisia annua L
- 作者
- Hongzhen Wang, Junli Han, Selvaraju Kanagarajan, Anneli Lundgren, Peter E. Brodelius
- 单位
- Department of Chemistry and Biomedicine, Linnaeus University, Kalmar, Sweden
- 杂志
- PLoS ONE（2013）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0080643
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
阐明青蒿中多种倍半萜合酶（CPS、ECS、FS等）的表达模式及其对青蒿素产量的潜在影响，评估竞争性代谢支路对青蒿素生物合成的制约。
研究策略
克隆CPS、ECS和FS的启动子，构建启动子-GUS融合载体转化青蒿，通过GUS组织化学染色分析时空表达模式；利用qPCR分析创伤和茉莉酸甲酯处理后野生型启动子的转录响应；同时比较与关键酶ADS启动子的表达差异。
核心内容
本研究克隆了青蒿中三个倍半萜合酶基因（CPS、ECS、FS）的启动子，长度分别为923 bp、1182 bp和1510 bp，并构建启动子-GUS融合载体转化青蒿，通过组织化学染色解析其时空表达模式。结果显示，CPS和ECS启动子主要在T型毛状体表达，而FS启动子同时具有腺毛活性，这与ADS启动子的表达模式形成对比。定量分析表明，CPS启动子活性在花中约为茎的200倍，ECS启动子在老叶中约为叶原基的30倍。创伤和茉莉酸甲酯处理下，各合酶转录呈现时间依赖性响应：茉莉酸甲酯处理后CPS、ECS、FS转录在16小时达到峰值，分别约为β-actin的0.2、1.6和0.03倍，而ADS在24小时达到约2倍峰值。花蕾中FS相对转录水平达β-actin的0.74倍，远高于ECS的0.01倍。研究揭示竞争性倍半萜合酶（尤其是FS）在青蒿素合成关键组织中活跃表达，提示下调FS可能通过减少FDP竞争而更有效地提高青蒿素产量，而CPS、ECS和GAS因转录水平低，下调其表达对产量提升意义有限。
创新点
首次克隆并表征了CPS、ECS、FS三个倍半萜合酶启动子，发现CPS和ECS启动子主要在T型毛状体表达而不在腺毛表达，FS启动子则在腺毛中也有活性，与ADS启动子形成对比；系统比较了四个倍半萜合酶启动子的创伤和MeJA响应。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Artemisia annua (转基因株系) | 倍半萜/青蒿素生物合成 | CPS | β-caryophyllene synthase | 催化 | 催化FDP环化生成β-石竹烯；启动子主要在T型毛状体表达，不在腺毛表达 |
| Artemisia annua (转基因株系) | 倍半萜/青蒿素生物合成 | ECS | epi-cedrol synthase | 催化 | 催化FDP环化生成表-雪松醇；启动子主要在T型毛状体表达，不在腺毛表达 |
| Artemisia annua (转基因株系) | 倍半萜/青蒿素生物合成 | FS | β-farnesene synthase | 催化 | 催化FDP生成β-法尼烯；启动子在腺毛和T型毛状体均有活性，与ADS共表达 |
| Artemisia annua (转基因株系) | 青蒿素生物合成 | ADS | amorpha-4,11-diene synthase | 催化 | 青蒿素生物合成关键限速酶，催化FDP环化为amorpha-4,11-diene；启动子特异在腺毛表达 |
| Artemisia annua (野生型/转基因株系) | 倍半萜生物合成 | GAS | germacrene A synthase | 催化 | 催化FDP生成大牻牛儿烯A；在花蕾和叶原基中转录水平较低，未进行启动子GUS研究 |
| Artemisia annua (转基因株系) | 报告基因 | GUS | β-glucuronidase | 催化 | 作为报告基因，用于检测CPS、ECS、FS及ADS启动子的活性 |
关键发现
- 克隆的CPS、ECS和FS启动子长度分别为923 bp、1182 bp和1510 bp
- CPS启动子活性在花中约为茎中的200倍，ECS启动子在老叶中约为叶原基的30倍
- 创伤诱导后四个合酶（ADS、CPS、ECS、FS）转录水平均呈现时间依赖性变化
- MeJA处理后，CPS、ECS、FS转录水平在16小时达到峰值（分别约为β-actin的0.2、1.6和0.03倍），而ADS在24小时达到约2倍峰值
- 在花蕾中，GAS、FS、ECS、CPS、ADS相对转录水平分别为β-actin的0.14、0.74、0.01、0.20和0.46倍，叶原基中分别为0.20、0.13、0.03、0.23和1.5倍
- Southern blot显示GUS基因以单拷贝（pCPS和pFS）或双拷贝（pECS和pADS）插入基因组
- CPS与FS的核苷酸序列在反义靶区域一致性为66.4%
- 青蒿素含量在品种间为干重的0.01%至0.8%。
研究结论
CPS、ECS和GAS的转录水平远低于ADS，下调这些基因可能不会显著提高青蒿素产量；FS在花蕾中相对表达较高且其启动子在腺毛中活跃，下调FS可能通过减少FDP竞争而提高青蒿素产量。