Identification and Characterization of a δ-Cadinol Synthase Potentially Involved in the Formation of Boreovibrins in Boreostereum vibrans of Basidiomycota
- 作者
- Hui Zhou, Yan-Long Yang, Jun Zeng, Ling Zhang, Zhi-Hui Ding, Ying Zeng
- 单位
- State Key Laboratory of Phytochemistry and Plant Resources in West China, Kunming Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences; University of Chinese Academy of Sciences
- 杂志
- Natural Products and Bioprospecting（2016）
- DOI
- 10.1007/s13659-016-0096-4
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
首次鉴定出一个以法尼基二磷酸为底物主要产生δ-cadinol的倍半萜合酶，该酶可能参与担子菌Boreostereum vibrans中boreovibrins的生物合成；此前尚无主要形成δ-cadinol的合酶报道。
研究策略
基于B. vibrans基因组草图预测的倍半萜合酶序列，通过RT-PCR克隆全长cDNA，构建pET32a+载体并在E. coli BL21(DE3)中异源表达，纯化重组蛋白后以FPP为底物进行体外酶活测定，利用GC-MS分析产物并鉴定。
核心内容
该研究首次从担子菌Boreostereum vibrans中鉴定并表征了一个以δ-cadinol为主要产物的倍半萜合酶BvCS。研究基于基因组草图预测的序列，通过RT-PCR克隆得到全长cDNA，构建pET32a+载体并在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达，经0.1 mM IPTG、15°C诱导22小时获得可溶性重组蛋白。体外酶活实验以法尼基二磷酸（FPP）为底物，GC-MS分析显示主要产物为δ-cadinol，同时产生少量germacrene D-4-ol、α-muurolene和γ-muurolene等副产物。序列比对表明BvCS与Coprinus cinereus的α-muurolene合酶及Termitomyces sp.的germacradienol/germacrene D合酶一致性均为49%。该酶是首次报道的主要生成δ-cadinol的倍半萜合酶，填补了此类酶在真菌中的空白，其催化机制可能经germacrene D途径进行。该发现为理解boreovibrins类化合物的生物合成奠定了基础，也为微生物生产δ-cadinol提供了新的酶学工具。
创新点
1. 首次报道以δ-cadinol为主要产物的倍半萜合酶（BvCS）；2. 该酶来源于担子菌Boreostereum vibrans，填补了此类合酶在真菌中的空白；3. 初步提出其通过germacrene D途径生成δ-cadinol。
研究对象（1）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 倍半萜生物合成途径 | BvCS | δ-cadinol synthase (BvCS) | 催化 | 异源表达宿主；重组酶以FPP为底物主要生成δ-cadinol，次要产物包括germacrene D-4-ol、α-muurolene和γ-muurolene。 |
关键发现
- 克隆的BvCS基因开放阅读框长1182 bp
- 重组蛋白约61 kDa
- 在0.1 mM IPTG、15°C诱导22 h获得可溶性表达。纯化后的重组酶以FPP为底物时，主要产物为δ-cadinol（保留时间18.68 min），次要产物包括germacrene D-4-ol（17.10 min）、α-muurolene（15.32 min）和γ-muurolene（14.76 min）。BvCS与Coprinus cinereus的α-muurolene合酶（Cop3）和Termitomyces sp. J132的germacradienol/germacrene D合酶的氨基酸序列一致性均为49%，与Stereum hirsutum的δ-cadinene合酶一致性为22%。
研究结论
成功从Boreostereum vibrans中克隆并异源表达了新的倍半萜合酶基因BvCS，重组酶以FPP为底物主要产生δ-cadinol，因此鉴定为δ-cadinol合酶，可能参与boreovibrins的生物合成。