Biosynthesis of Phytoene from Isopentenyl Pyrophosphate by a Neurospora Enzyme System
- 作者
- Sandra L. Spurgeon, Richard V. Turner, Roy W. Harding
- 单位
- Radiation Biology Laboratory, Smithsonian Institution, Rockville, Maryland 20852
- 杂志
- Archives of Biochemistry and Biophysics（1979）
- DOI
- 10.1016/0003-9861(79)90323-0
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)中八氢番茄红素(phytoene)从头合成的酶学基础及其蓝光光调控机制——尤其是从异戊烯基焦磷酸(IPP)到八氢番茄红素的转化由哪些酶催化、该酶活性受蓝光如何调节，以及albino突变体在其中的角色。
研究策略
建立无细胞酶活测定体系：从N. crassa菌丝体制备100,000g上清（含浑浊膜层）作为粗酶，以[1-14C]异戊烯基焦磷酸为底物，通过己烷提取、氧化铝柱层析和薄层/气液色谱鉴定八氢番茄红素产物；结合蓝光活体照射、放线菌酮抑制、温度处理以及albino突变株比较，分析酶活性的光诱导调控。
核心内容
该研究从粗糙脉孢菌菌丝体中建立了无细胞酶活测定体系，以放射性标记的异戊烯基焦磷酸为底物，分离并鉴定出催化其转化为十五顺式八氢番茄红素的酶系统。研究发现该酶系统对镁离子具有绝对需求，缺失镁离子时产物掺入为零，且不依赖NADP+、FAD、Tween 80或DTT等辅因子。蓝光活体照射两分钟后，酶活性在低温条件下升高约9倍，该诱导过程依赖从头蛋白质合成，对放线菌酮敏感。通过比较albino突变株发现，albino-1突变体的光诱导行为与野生型一致，表明类胡萝卜素并非蓝光光受体；而albino-2和albino-3突变体完全缺失该酶活性。实验还揭示膜结合组分对八氢番茄红素和角鲨烯的合成均为必需，提示相关催化酶为膜结合酶。该工作首次提供了粗糙脉孢菌类胡萝卜素生物合成光调控的无细胞酶学证据，为后续解析该途径的酶学机制奠定了基础。
创新点
['首次从粗糙脉孢菌中分离出催化异戊烯基焦磷酸转化为八氢番茄红素的无细胞酶系统', '证明该酶系统对Mg2+具有绝对需求，且不依赖NADP+、FAD、Tween 80或DTT等其他辅因子（NADP+主要用于角鲨烯合成）', '明确蓝光活体照射可诱导八氢番茄红素合成酶活性升高约9倍，且诱导过程依赖从头蛋白质合成（对放线菌酮敏感）', '利用albino-1突变体证明蓝光光受体不是类胡萝卜素本身', '揭示膜结合组分（浑浊层）对八氢番茄红素合成和角鲨烯合成是必需的']
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Neurospora crassa（粗糙脉孢菌） | 类胡萝卜素生物合成 | — | 八氢番茄红素合成酶系（催化IPP→八氢番茄红素） | 催化 | 无细胞粗酶系统（100,000g上清含浑浊膜层）催化异戊烯基焦磷酸生成15-顺式八氢番茄红素；绝对依赖Mg2+（缺MgCl2时活性为0），无需NADP+/FAD/DTT/Tween 80 |
| Neurospora crassa 野生型 Em 5297 (FGSC 352) | 类胡萝卜素生物合成（光调控） | — | — | 调控 | 暗处低活性，2 min蓝光照射（48 μW·cm-2）后24 h酶活升高约9倍；诱导被放线菌酮抑制、对温度敏感（25°C仅3倍，6°C约9倍） |
| Neurospora crassa albino-1（RFS-6 mt A） | 类胡萝卜素生物合成 | albino-1 | — | 调控 | albino-1突变株展示与野生型相似的蓝光诱导酶活性升高和暗处低水平活性；因其几乎不产生类胡萝卜素色素，提示色素不是光受体 |
| Neurospora crassa albino-2（FGSC 904） | 类胡萝卜素生物合成 | albino-2 | — | 催化 | 暗处或蓝光照射培养的提取物均检测不到IPP向八氢番茄红素的转化活性，体内亦不积累八氢番茄红素；该基因产物为合成途径所必需 |
| Neurospora crassa albino-3（FGSC 2082） | 类胡萝卜素生物合成 | albino-3 | — | 催化 | 同albino-2，暗处或光照培养均无八氢番茄红素合成活性，体内不积累八氢番茄红素 |
| Neurospora crassa | 萜类生物合成（角鲨烯合成支路） | — | 角鲨烯合成酶（squalene synthetase） | 催化 | 催化法尼基焦磷酸→角鲨烯，依赖NADPH；去除NADP+几乎完全丧失角鲨烯合成（八氢番茄红素略增至6700 dpm），可能为膜结合酶 |
| Neurospora crassa | 类胡萝卜素生物合成（GGPP→八氢番茄红素） | — | 膜结合酶（未鉴定） | 区室化 | 100,000g上清底部的浑浊层（疑似膜碎片及相关酶）是八氢番茄红素和角鲨烯合成所必需；缺少该组分时主要合成酸不稳定化合物 |
关键发现
- ['首次从粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)菌丝体分离出催化异戊烯基焦磷酸(IPP)转化为八氢番茄红素的无细胞酶系统
- 产物经鉴定为15-顺式八氢番茄红素，氢化后超过95%的放射性保留在产物中，94%的标记在气液色谱中与标准全氢八氢番茄红素共洗脱于单一峰。', '该酶系统绝对依赖Mg2+：缺MgCl2时掺入为0 dpm（完整体系为6000 dpm/0.3 mg蛋白/45 min）
- Mg2+最适浓度高于10 mM，Mn2+仅在低于1 mM时可部分替代且在高于1 mM时抑制，15 mM Mg2+存在下Mn2+仍抑制。', '暗处生长6天的野生型菌丝仅具低水平八氢番茄红素合成活性
- 2 min蓝光活体照射(48 μW·cm-2，400-510 nm)后24 h，酶活性升高约9倍，且升高主要发生在光照后最初12 h，前8 h内随时间呈近似线性上升。', '25°C下蓝光诱导的活性升高最多仅约3倍（1 h达峰值），而6°C下可达约9倍（持续12 h），表明低温有利于光诱导。', '放线菌酮(12.3 μM)在光照后2 h内加入可完全阻断酶活性升高，随加入时间推迟抑制作用递减，光照后8 h再加入则完全无效
- 放线菌酮对体外酶活性无直接抑制。', 'albino-1突变株的八氢番茄红素合成活性与野生型类似（暗处低水平、蓝光诱导升高，且对光照时间有相似的依赖），提示类胡萝卜素色素不是蓝光光受体
- albino-2和albino-3突变株在暗处和光照培养下均检测不到该酶活性。', '辅因子研究表明：去除NADP+后八氢番茄红素合成反而略增(6700 dpm)但角鲨烯合成几乎完全丧失
- 去除Tween 80(5900 dpm)、FAD(5800 dpm)或DTT(5700 dpm)对八氢番茄红素合成影响很小。', '100,000g超离上清底部的浑浊层（推测为膜碎片及膜结合酶）是八氢番茄红素和角鲨烯合成所必需
- 缺少该组分时主要生成酸不稳定化合物，提示催化GGPP→八氢番茄红素及法尼基焦磷酸→角鲨烯的酶为膜结合酶。']
研究结论
本研究表明粗糙脉孢菌中催化IPP转化为八氢番茄红素的酶系统仅需Mg2+作为绝对辅因子，无细胞系统可在暗处生长的菌丝中检出低活性；蓝光照射经依赖于蛋白质合成的机制将活性诱导升高至约9倍（6°C下），光受体并非类胡萝卜素。albino-2和albino-3突变体完全缺失该活性，而albino-1突变体的光诱导与野生型一致。部分合成步骤可能由膜结合酶完成。研究为在N. crassa中解析类胡萝卜素生物合成的光调控提供了首个无细胞酶学证据。