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Expression of Mammalian Liver Glycolytic/ Gluconeogenic Enzymes in Escherichia coli: Recovery of Active Enzyme Is Strain and Temperature Dependent

作者
K. Lin, I. Kurland, L. Z. Xu, A. J. Lange, J. Pilkis, M. R. El-Maghrabi, S. J. Pilkis
单位
Department of Physiology and Biophysics, State University of New York, Stony Brook, New York 11794-8661
杂志
Protein Expression and Purification（1990）
DOI
10.1016/1046-5928(90)90012-n
所属领域
蛋白质表达/代谢工程
关键词
6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphataseE. coli expressionT7 RNA polymerase systemactive enzyme recoveryfructose-1,6-bisphosphataseglucokinaseinduction temperature
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解决的核心问题

在E. coli中利用T7 RNA聚合酶系统表达哺乳动物肝糖酵解/糖异生酶时，可溶活性酶回收率极低（通常小于1 mg/L培养物），大量蛋白以无活性或包涵体形式累积。

研究策略

通过降低诱导温度（从37°C降至22°C）和使用含T7溶菌酶质粒的BL21(DE3)pLysS宿主菌株来减缓蛋白合成速率，从而促进正确折叠并提高活性酶的回收率。

研究路线图

100%
问题：哺乳动物肝糖酵解/糖异生酶在大肠杆菌中可溶活性回收率低（<1 mg/L），大量蛋白累积为包涵体
策略：降低诱导温度（37→22°C） + 使用BL21(DE3)pLysS菌株（含T7溶菌酶）减缓蛋白合成速率
关键改造 1：低温诱导（22°C, 40-48 h）提高热不稳定酶活性产量10-30倍
关键改造 2：BL21(DE3)pLysS菌株+T7溶菌酶进一步延缓表达速率，提高活性产量
结果 1：6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶：22°C+BL21(DE3)pLysS达11-13 mg/L（37°C仅0.5 mg/L）
结果 2：葡萄糖激酶：22°C+BL21(DE3)pLysS达10-12 mg/L（37°C仅0.6 mg/L）；果糖-2,6-二磷酸酶结构域：22°C+B121(DE3)达10-12 mg/L
结果 3：果糖-1,6-二磷酸酶为热稳定酶，对温度不敏感，37°C活性回收率约66%（BL21(DE3)优于pLysS）
结论：低温诱导+pLysS策略对热不稳定酶有效，但对热稳定酶不适用；酶自身热稳定性决定活性回收率
纯化方案：PEG分级+磷酸纤维素亲和层析一步纯化，产率74%，比活力37 mU/mg，产物为55 kDa均一蛋白；动力学性质与天然酶一致
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核心内容

该研究系统考察了利用T7 RNA聚合酶系统在大肠杆菌中表达四种大鼠肝脏糖酵解/糖异生酶时，诱导温度与宿主菌株对活性酶回收率的影响。研究发现，37°C诱导4小时虽可使6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶总蛋白积累达45 mg/L，但活性酶仅占总蛋白的0.6%–0.8%，大量蛋白以无活性形式存在。将诱导温度降至22°C并延长诱导时间至40–48小时后，配合BL21(DE3)pLysS菌株，该双功能酶的活性产量提升至11–13 mg/L，较37°C提高约20倍；葡萄糖激酶与果糖-2,6-二磷酸酶结构域在低温条件下的活性产量分别达10–12 mg/L，而37°C时不足1 mg/L。值得注意的是，果糖-1,6-二磷酸酶对温度不敏感，37°C与22°C下的活性回收率均约为66%，且BL21(DE3)菌株优于pLysS菌株。经PEG分级与磷酸纤维素亲和层析，双功能酶纯化22倍，产率74%，比活力37 mU/mg，且重组酶与天然酶的动力学性质一致。结果表明，低温诱导可有效提高热不稳定哺乳动物酶的活性回收率，但该策略不适用于热稳定性良好的酶，蛋白质自身热稳定性是决定活性回收的关键因素。

创新点

系统研究了诱导温度和宿主菌株对四种大鼠肝酶（6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶、果糖-2,6-二磷酸酶结构域、葡萄糖激酶、果糖-1,6-二磷酸酶）活性回收的影响；发现低温诱导可将活性酶产量提高20-30倍，并开发了基于磷酸纤维素单步亲和层析的高效纯化方案。

研究对象（6）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Escherichia coli BL21(DE3) 糖酵解/糖异生 — 6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶 (6PF-2-K/Fru-2,6-P2ase) 催化 大鼠肝双功能酶，使用pET载体表达，37°C诱导时活性酶仅0.5-1 mg/L，22°C诱导时升至7 mg/L。
Escherichia coli BL21(DE3)pLysS 糖酵解/糖异生 — 6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶 (6PF-2-K/Fru-2,6-P2ase) 催化 含T7溶菌酶质粒，22°C诱导时活性酶产量达11-13 mg/L，优于BL21(DE3)。
Escherichia coli BL21(DE3) 糖酵解/糖异生 — 果糖-2,6-二磷酸酶结构域 (Fru-2,6-P2ase) 催化 6PF-2-K/Fru-2,6-P2ase的单独双磷酸酶结构域，22°C诱导时活性产量10-12 mg/L。
Escherichia coli BL21(DE3) 糖酵解 — 葡萄糖激酶 (Glucokinase) 催化 大鼠肝葡萄糖激酶，22°C诱导时活性产量2 mg/L（BL21(DE3)），在pLysS菌株中达10-12 mg/L。
Escherichia coli BL21(DE3) 糖异生 — 果糖-1,6-二磷酸酶 (Fru-1,6-P2ase) 催化 热稳定酶，37°C和22°C活性回收率均约66%，BL21(DE3)菌株在37°C下活性产量14 mg/L。
Escherichia coli BL21(DE3)pLysS — — T7溶菌酶 (T7 lysozyme) 调控 由pLysS质粒编码，抑制T7 RNA聚合酶，降低表达速率，提高活性酶回收。

关键发现

  1. 在37°C诱导4h时，6PF-2-K/Fru-2,6-P2ase总蛋白积累达45 mg/L，但活性酶仅占总表达蛋白的0.6%-0.8%（约0.5 mg/L）
  2. 在22°C诱导40-48h时，BL21(DE3)中活性酶产量升至7 mg/L（提高14倍），BL21(DE3)pLysS中达11-13 mg/L
  3. 葡萄糖激酶在22°C、BL21(DE3)pLysS中活性产量为10-12 mg/L，而37°C仅0.6 mg/L
  4. 果糖-2,6-二磷酸酶结构域在22°C、BL21(DE3)中活性产量为10-12 mg/L，37°C仅0.5-1.0 mg/L
  5. 果糖-1,6-二磷酸酶对温度不敏感，37°C时活性回收率约66%，22°C仍约66%，且BL21(DE3)菌株优于pLysS菌株。纯化6PF-2-K/Fru-2,6-P2ase经PEG分级和磷酸纤维素亲和层析，产率74%，比活力37 mU/mg，纯化22倍，产物为均一的55 kDa蛋白。E. coli表达的双功能酶与天然大鼠肝酶动力学性质基本一致。

研究结论

降低诱导温度（22°C）并配合BL21(DE3)pLysS宿主菌株可大幅提高在E. coli中表达的热不稳定哺乳动物酶的活性回收率，但该策略不适用于本身热稳定的酶（如果糖-1,6-二磷酸酶）。蛋白质本身的热稳定性也是决定活性回收的重要因素。