Enzymatic Synthesis of Isotopically Labeled Isoprenoid Diphosphates
- 作者
- Dale J. Christensen, C. Dale Poulter
- 单位
- University of Utah, Department of Chemistry, Salt Lake City, UT 84112, U.S.A.
- 杂志
- Bioorganic & Medicinal Chemistry（1994）
- DOI
- 10.1016/0968-0896(94)85011-9
- 所属领域
- 生物催化
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解决的核心问题
缺乏商业来源的同位素标记异戊二烯二磷酸盐中间体，需要一种简单高效的方法合成13C标记的IPP、DMAPP及FPP，用于生物合成途径研究。
研究策略
用化学合成法制备[2,4,5-13C3]标记的IPP和DMAPP，再利用重组酵母IPP异构酶和鸟FPP合酶与不同的底物组合，酶促缩合选择性生成标记的FPP。
核心内容
该研究建立了一种利用重组酶从简单标记前体酶促合成同位素标记异戊二烯二磷酸盐的方法。研究者以乙基[2-13C]溴乙酸酯和[1,3-13C2]丙酮为原料，经化学合成制备[2,4,5-13C3]标记的IPP和DMAPP，随后利用重组酵母IPP异构酶和鸟FPP合酶的不同底物组合，选择性生成13C标记的FPP。在E. coli JM101中异源表达的两种酶分别占细胞蛋白的30–40%。三批酶促反应各获得10–12 mg纯化的13C标记FPP，产率约88–90%。通过13C NMR确认了标记位置，并实现了对FPP第一个、第三个或全部三个异戊二烯单元的选择性标记。该方法产率高、操作简便，无需复杂标记前体，可推广至13C、放射性及氘标记，为类异戊二烯生物合成途径的机制研究和代谢流分析提供了实用的工具。
创新点
利用重组IPP异构酶和FPP合酶实现FPP的选择性同位素标记；仅需简单的标记前体（乙基[2-13C]溴乙酸酯和[1,3-13C2]丙酮）；可选择性标记FPP第一个或第三个异戊二烯单元或全部三个单元；产率高达约90%。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli JM101 | 异戊二烯生物合成途径（IPP/DMAPP → FPP） | — | 酵母异戊烯基二磷酸异构酶（IPP isomerase） | 催化 | 将IPP异构化为DMAPP，用于FPP合成 |
| Escherichia coli JM101 | 异戊二烯生物合成途径（IPP/DMAPP → FPP） | — | 鸟法尼基二磷酸合酶（avian farnesyl diphosphate synthase） | 催化 | 催化IPP与DMAPP或GPP缩合生成FPP |
关键发现
- 从乙基[2-13C]溴乙酸酯和[1,3-13C2]丙酮合成了[2,4,5-13C3]IPP和DMAPP
- 在重组酶作用下，三批孵育各获得10-12 mg纯化13C标记FPP，产率约88-90%
- E. coli JM101/pIPS24121和JM101/pMJy9-11中IPP异构酶和FPP合酶分别占细胞蛋白的30-40%
- 通过13C NMR确认标记位置，例如[13C9]FPP的化学位移等。
研究结论
建立了一种用重组酶从简单标记前体酶促合成选择性同位素标记FPP的方法，可标记第一个、第三个或全部三个异戊二烯单元，适用于13C和放射性标记，以及氘标记。