高级醇 · 代谢工程文献库

← 返回列表

Platesimycin and Platencin Biosynthesis in Streptomyces platensis, Showcasing Discovery and Characterization of Novel Bacterial Diterpene Synthases

作者
Michael J. Smanski, Ryan M. Peterson, Ben Shen
单位
Microbiology Doctoral Training Program, University of Wisconsin-Madison, Madison, Wisconsin, USA; Division of Pharmaceutical Sciences, University of Wisconsin-Madison, Madison, Wisconsin, USA; Department of Chemistry, The Scripps Research Institute, Jupiter, Florida, USA; Department of Molecular Therapeutics, The Scripps Research Institute, Jupiter, Florida, USA; Natural Products Library Initiative at TSRI, The Scripps Research Institute, Jupiter, Florida, USA
杂志
Methods in Enzymology（2012）
DOI
10.1016/B978-0-12-394290-6.00008-2
所属领域
合成生物学
关键词
Streptomyces platensisbacterial diterpene synthasesditerpenoid biosynthesisplatencinplatensimycin
阅读原文
查看 PDF 原文

解决的核心问题

鉴定和表征参与platensimycin（PTM）和platencin（PTN）生物合成的新型细菌二萜合酶（DTS），并建立系统的体内外研究方法。

研究策略

结合生物信息学分析、λ-RED介导的基因替换/敲除、异源表达、蛋白纯化及体外酶活测定，对候选DTS进行功能验证。

研究路线图

100%
研究问题：鉴定新型细菌二萜合酶
策略：生信筛选+基因敲除+异源表达
关键改造1：ΔptmT3/ΔptmT1基因替换
关键改造2：PtmT2/PtmT3体外酶活
结果1：ΔptmT3只影响PTM；ΔptmT1只影响PTN
结果2：异源ptmT3使MA7339转为双产菌株
结论：建立完整DTS研究方法体系
Text is not SVG - cannot display

下载 .drawio 源文件

核心内容

该研究围绕平野霉素（PTM）和平野素（PTN）的生物合成，系统鉴定并表征了新型细菌二萜合酶。通过生物信息学预测结合λ-RED介导的基因敲除、异源表达与体外酶活测定，研究确认PtmT2/PtnT2为ent-CDP合酶，PtmT3/PtnT3为ent-kauran-16-ol合酶，PtmT1/PtnT1为ent-atiserene合酶。基因敲除实验显示，ΔptmT3突变完全消除PTM产生但不影响PTN，ΔptmT1突变则反之，证明两条途径共享部分前体但分支独立。纯化蛋白产量约40–50 mg/L，化学合成底物GGDP产率30–40%。通过异源表达ptmT3，成功将PTN专一产株MA7339转变为PTM/PTN双产株SB12604，验证了关键酶的体内功能。该工作建立了一套从基因到产物的完整细菌二萜合酶研究方法，为发现新型二萜合酶和改造相关代谢途径提供了通用工具。

创新点

首次鉴定出参与PTM/PTN生物合成的ent-kauran-16-ol合酶（PtmT3/PtnT3）和ent-atiserene合酶（PtmT1/PtnT1），并建立了从GGDP合成到产物鉴定的完整DTS研究方法。

研究对象（6）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Streptomyces platensis MA7327 platensimycin/platencin生物合成 ptmT3 PtmT3 催化 I型DTS，ent-kauran-16-ol合酶，负责PTM生物合成中ent-kaurene中间体的形成。
Streptomyces platensis MA7327 platensimycin/platencin生物合成 ptmT1 PtmT1 催化 I型DTS，ent-atiserene合酶，负责PTN生物合成中ent-atiserene中间体的形成。
Streptomyces platensis MA7339 platencin生物合成 ptnT1 PtnT1 催化 I型DTS，ent-atiserene合酶，MA7339仅产生PTN。
Streptomyces platensis MA7339 platencin生物合成 ptmT3 PtmT3 催化 通过异源表达ptmT3将MA7339转化为PTM/PTN双产菌株SB12604。
Escherichia coli BL21(DE3) 异源表达与体外酶活表征 ptmT2 PtmT2 催化 II型DTS，ent-CDP合酶，催化GGDP环化为ent-CDP。
Escherichia coli BL21(DE3) 异源表达与体外酶活表征 ptmT3 PtmT3 催化 I型DTS，ent-kauran-16-ol合酶，以ent-CDP为底物。

关键发现

  1. ΔptmT3突变完全消除PTM产生但不影响PTN产生
  2. ΔptmT1突变完全消除PTN产生但不影响PTM产生。PtmT2/PtnT2为ent-CDP合酶，PtmT3为ent-kauran-16-ol合酶。纯化蛋白产量约40-50 mg/L
  3. GGDP化学合成产率30-40%。通过异源表达ptmT3将PTN专一产株MA7339转变为PTM/PTN双产株SB12604。

研究结论

建立了一套完整的细菌DTS研究方法，可用于发现和表征新型二萜合酶，拓展对细菌二萜生物合成的理解，并为代谢途径工程提供有力工具。