Effect of oxygen supply on passaging, stabilising and screening of recombinant Hansenula polymorpha production strains in test tube cultures
- 作者
- Christoph Stöckmann, Mario Losen, Ulrike Dahlems, Christof Knocke, Gerd Gellissen, Jochen Büchs
- 单位
- Department of Biochemical Engineering, RWTH Aachen University, Sammelbau Biologie, Worringerweg 1, D-52056 Aachen, Germany; Rhein Biotech GmbH, Eichsfelder Straße 11, 40595 Düsseldorf, Germany
- 杂志
- FEMS Yeast Research（2003）
- DOI
- 10.1016/S1567-1356(03)00147-8
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
研究氧气供应对重组Hansenula polymorpha生产菌株在试管培养中传代、稳定化和筛选的影响，以避免不利代谢并提高重组植酸酶产量。
研究策略
通过对试管培养进行水动力学和氧传递表征，确定限氧和非限氧条件；在葡萄糖培养基中传代、YPD中稳定化、甘油培养基中筛选；利用在线OTR/CTR监测和HPLC分析代谢物；测定植酸酶活性。
核心内容
该研究系统考察了氧气供应对重组Hansenula polymorpha生产菌株在试管培养中传代、稳定化及筛选过程的影响。研究者通过水动力学和氧传递表征确定限氧与非限氧条件，结合在线氧传递速率/二氧化碳释放速率监测、高效液相色谱代谢物分析及植酸酶活性测定，系统评估不同供氧策略的效果。结果显示，限氧葡萄糖培养产生4.1 g/L乙醇和0.8 g/L乙酸，最终生物量达5.4 g/L，而非限氧培养产生2.1 g/L乙酸，生物量仅3.5 g/L。在甘油筛选培养基中，无论供氧条件如何均无副产物形成，最大比生长速率为0.23/h。值得注意的是，非限氧预培养导致20小时延迟期，而限氧预培养无延迟现象。限氧条件下植酸酶活性平均比非限氧高25%，且24个转化子中12个几乎没有植酸酶活性（<2 FTU/ml），10个保持高活性。该研究证明在试管批量培养中通过控制氧限制可避免溢流代谢和乙酸抑制，实现更高效植酸酶生产，供氧条件的合理设计对菌株筛选和过程开发至关重要。
创新点
建立了试管培养中最大氧传递能力的测定方法；证明了在传代和筛选中引入控制氧限制比非限氧条件更有利；发现限氧条件下植酸酶活性平均提高25%。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Hansenula polymorpha RB11 | 重组蛋白表达 | URA3 | 乳清苷-5'-磷酸脱羧酶 | 催化 | 用作转化子的选择标记，补充宿主尿嘧啶营养缺陷型 |
| Hansenula polymorpha RB11 | 植酸酶表达 | 植酸酶基因 | 植酸酶 | 催化 | 由FMD启动子驱动，分泌表达，作为报告蛋白 |
| Hansenula polymorpha RB11 | 基因表达调控 | FMD启动子 | 无 | 调控 | 受葡萄糖阻遏、甘油解阻遏，用于控制植酸酶表达 |
关键发现
- 氧限制葡萄糖培养产生4.1 g/L乙醇和0.8 g/L乙酸，最终生物量达5.4 g/L
- 非限氧培养产生2.1 g/L乙酸，生物量仅3.5 g/L。甘油筛选培养基中无论供氧条件均无副产物形成，最大比生长速率为0.23/h。非限氧预培养导致20小时延迟期，而限氧预培养无延迟。限氧条件下植酸酶活性平均比非限氧高25%。24个转化子中12个几乎没有植酸酶活性（<2 FTU/ml），10个保持高活性，2个活性增加。试管在300 rpm、2 ml装液量时OTRmax可达0.14 mol/L/h。
研究结论
在试管批量培养中，通过控制氧限制可以避免溢流代谢和乙酸抑制，实现更高效的植酸酶生产；供氧条件的合理设计对菌株筛选和过程开发至关重要。