Genomics-Based Discovery of Plant Genes for Synthetic Biology of Terpenoid Fragrances: A Case Study in Sandalwood oil Biosynthesis
- 作者
- J.M. Celedon, J. Bohlmann
- 单位
- Michael Smith Laboratories, University of British Columbia, Vancouver, BC, Canada
- 杂志
- Methods in Enzymology（2016）
- DOI
- 10.1016/bs.mie.2016.03.008
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
非模式植物中香料萜类化合物生物合成基因的发现，特别是檀香中负责(Z)-檀香醇最终合成的P450酶。
研究策略
整合组织特异性转录组测序（RNA-seq）、代谢物谱分析、差异表达基因挖掘及酵母体内/体外功能表征的策略，系统鉴定檀香心材中倍半萜香料生物合成途径的关键基因。
核心内容
该研究以檀香油生物合成为案例，提出了一套从非模式植物中发掘香料萜类基因的基因组学策略。作者对檀香心材和边材各四个生物学重复进行转录组测序（每文库约6600万reads）并结合代谢物谱分析，发现甲羟戊酸途径在心材中优先表达，而甲基赤藓醇磷酸途径在边材中优先表达，其中倍半萜合酶基因SaSSy表现心材特异性高表达。通过差异表达筛选候选细胞色素P450基因，结合酵母体内共表达和体外功能表征，鉴定出SaCYP736A167是催化(Z)-檀香醇最终合成的关键酶。在酿酒酵母AM94菌株中共表达SaFPPS、SaSSy、SaCPR和SaCYP736A167后，成功产生(Z)-α-檀香醇、(Z)-β-檀香醇、(Z)-α-外型-佛手柑醇和(Z)-epi-β-檀香醇，产物组成比例与天然檀香油高度相似。该工作揭示了檀香油生物合成的最后步骤，并证明了从非模式植物中发掘基因并在酵母中重建完整通路的可行性，为萜类香料的合成生物学研究提供了可推广的方法框架。
创新点
利用心材特异转录组与代谢组联合分析，锁定檀香油生物合成候选P450基因；通过酵母体内共表达系统重建完整途径，首次鉴定SaCYP736A167为催化(Z)-檀香醇等产物合成的关键P450，并实现了与天然檀香油组成比例相近的产物谱。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) AM94菌株 | 檀香油倍半萜生物合成通路 | SaMonoTPS1 | SaMonoTPS1 酶 | 催化 | 单萜合酶，产生(+)-α-萜品醇和(-)-柠檬烯 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) AM94菌株 | 檀香油倍半萜生物合成通路 | SaSesquiTPS1 | SaSesquiTPS1 酶 | 催化 | 倍半萜合酶，产生大根香叶烯D-4-醇等 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) AM94菌株 | 檀香油倍半萜生物合成通路 | SaSSy | SaSSy 酶 | 催化 | 檀香烯合酶，产生α-檀香烯、β-檀香烯、epi-β-檀香烯和α-外型-佛手柑烯 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) AM94菌株 | 檀香油倍半萜生物合成通路 | SaCYP736A167 | SaCYP736A167 酶 | 催化 | 细胞色素P450，催化(Z)-α-檀香醇、(Z)-β-檀香醇、(Z)-α-外型-佛手柑醇和(Z)-epi-β-檀香醇的合成 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) AM94菌株 | 前体供应通路（甲羟戊酸通路） | SaFPPS | SaFPPS 酶 | 催化 | 法尼基焦磷酸合酶，产生FPP前体 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) AM94菌株 | P450氧化还原系统 | SaCPR2 | SaCPR2 蛋白 | 催化 | 细胞色素P450还原酶，为P450提供电子 |
关键发现
- 测序深度约6600万reads/文库，12个文库（每个组织4个生物学重复）用于从头组装
- 在檀香心材（HW）中MEV通路优先表达，而MEP通路在边材（SW）优先表达
- SaSSy是心材中表达最强的TPS基因且具有心材特异性
- 通过候选P450筛选鉴定出SaCYP736A167
- 酵母共表达SaFPPS、SaSSy、SaCPR和SaCYP736A167后产生(Z)-α-檀香醇、(Z)-β-檀香醇、(Z)-α-外型-佛手柑醇和(Z)-epi-β-檀香醇，产物比例与天然檀香油相似。
研究结论
本研究通过基因组/转录组驱动的策略，成功揭示了檀香油生物合成的最后步骤（由SaCYP736A167催化的(Z)-檀香醇生成），并展示了从非模式植物中发现香料生物合成基因并在酵母中重建完整通路的可行性，为萜类香料的合成生物学提供了一般性方法。