Amorpha-4,11-diene synthase: Mechanism and stereochemistry of the enzymatic cyclization of farnesyl diphosphate
- 作者
- Sarah Picaud, Per Mercke, Xiaofei He, Olov Sterner, Maria Brodelius, David E. Cane, Peter E. Brodelius
- 单位
- Department of Chemistry and Biomedical Science, University of Kalmar, SE-39182 Kalmar, Sweden; Department of Chemistry, Brown University, Providence, Rhode Island 02912-9108, USA; Department of Organic Chemistry, Lund University, P.O. Box 124, SE-22100 Lund, Sweden
- 杂志
- Archives of Biochemistry and Biophysics（2005）
- DOI
- 10.1016/j.abb.2005.07.015
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
解析青蒿素生物合成关键酶amorpha-4,11-diene synthase催化法尼基焦磷酸(FPP)环化生成amorpha-4,11-diene的反应机理，特别是氢迁移路径和立体化学。
研究策略
利用立体选择性氘标记的FPP底物（(1R)-[1-2H]FPP、(1S)-[1-2H]FPP和[1,1-2H2]FPP），通过GC-MS和质子NMR/COSY分析产物中氘的位置，从而推断环化机制。
核心内容
本研究通过立体选择性氘标记实验，解析了青蒿素生物合成关键酶amorpha-4,11-diene synthase（ADS）催化法尼基焦磷酸（FPP）环化生成amorpha-4,11-diene的详细机理。研究者使用重组ADS分别与(1R)-[1-2H]FPP、(1S)-[1-2H]FPP和[1,1-2H2]FPP三种氘标记底物孵育，经GC-MS分析显示产物分子离子分别偏移1、1和2 AMU，说明所有氘原子均被保留。关键在于碎裂离子分析发现，离子c仅在(1R)-[1-2H]FPP和[1,1-2H2]FPP来源产物中偏移1 AMU，而在(1S)-[1-2H]FPP来源产物中不偏移，同时1H NMR和COSY谱证实(1S)-[1-2H]FPP产物缺少H-10但保留H-6，而(1R)-[1-2H]FPP产物相反，从而首次明确证明ADS催化过程中存在1,3-氢迁移，即H-1si质子定向转移至C-10。此外，ADS催化FPP还产生α-bisabolol（占总倍半萜1.6%）、(+)-zingiberene（0.2%）、zingiberenol（0.4%）和(+)-β-sesquiphellandrene（1.8%）等副产物，为双abolyl阳离子中间体的存在提供了支持。这些结果完整阐明了ADS的催化路径：FPP先异构化为(3R)-神经醇焦磷酸，经C1,C6环化生成双abolyl阳离子，随后发生1,3-氢迁移、1,10-环化和去质子化。该机制与其它倍半萜合酶采用初始1,10-环化策略不同，为理解青蒿素前体生物合成的立体化学控制提供了分子基础，对青蒿素异源生产的酶工程改造具有指导意义。
创新点
首次通过立体特异性氘标记实验证明ADS催化过程中存在1,3-氢迁移，明确H-1si质子转移至C-10；阐明了初始1,6-环化与随后1,10-环化的反应顺序。
研究对象（1）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 青蒿素生物合成途径（amorpha-4,11-diene合成） | ADS cDNA（来自黄花蒿 Artemisia annua） | Amorpha-4,11-diene synthase（ADS） | 催化 | 重组表达用于酶促反应研究；催化FPP环化生成amorpha-4,11-diene，并产生少量双abolane型副产物 |
关键发现
- 使用重组amorpha-4,11-diene synthase与氘标记底物孵育，GC-MS显示由(1R)-[1-2H]FPP、(1S)-[1-2H]FPP和[1,1-2H2]FPP生成的amorpha-4,11-diene分子离子分别偏移1、1、2 AMU，表明所有氘原子保留。碎裂离子分析表明，离子b（C6-C7和C9-C10断裂）保留所有底物的氘
- 离子c在(1R)-[1-2H]FPP和[1,1-2H2]FPP来源产物中偏移1 AMU，而在(1S)-[1-2H]FPP来源产物中不偏移，证明H-1si质子转移至C-10。1H NMR和COSY确认(1R)-[1-2H]FPP产物缺少H-6信号但保留H-10，(1S)-[1-2H]FPP产物保留H-6但缺少H-10，且H-10/H-15相关峰消失。此外，ADS催化FPP还产生副产物α-bisabolol（占总倍半萜1.6%）、(+)-zingiberene（0.2%）、zingiberenol（0.4%）和(+)-β-sesquiphellandrene（1.8%），支持双abolyl阳离子中间体的存在。
研究结论
研究结果支持先前提出的ADS催化机制：FPP先经离子化并异构化为(3R)-神经醇焦磷酸(NPP)，经C1,C6环化生成双abolyl阳离子，随后发生1,3-氢迁移（H-1si转移到C-10），再经1,10-环化和去质子化生成(1S,6R,7R,10R)-amorpha-4,11-diene。该机制与其它4,10-二甲基-7-异丙基八氢萘类倍半萜通过初始1,10-环化不同，ADS采用初始1,6-环化后接1,3-氢迁移和1,10-环化。