Two pockets in the active site of maize sesquiterpene synthase TPS4 carry out sequential parts of the reaction scheme resulting in multiple products
- 作者
- Tobias G. Köllner, Paul E. O'Maillle, Nathalie Gatto, Wilhelm Boland, Jonathan Gershenzon, Jörg Degenhardt
- 单位
- Max Planck Institute for Chemical Ecology, Hans-Knöll Strasse 8, D-07745 Jena, Germany; The Salk Institute for Biological Studies, La Jolla, CA 92037, USA
- 杂志
- Archives of Biochemistry and Biophysics（2005）
- DOI
- 10.1016/j.abb.2005.10.011
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
玉米倍半萜合酶TPS4如何通过活性位点的结构特征控制复杂的多步碳正离子反应，从而产生14种不同倍半萜产物的机制尚不清楚。
研究策略
基于5-epi-aristolochene合酶（TEAS）晶体结构进行同源建模，对底物法尼基二磷酸、多个碳正离子中间体及终产物进行分子对接模拟；结合定点突变和（E,E）-FPP与（Z,E）-FPP两种底物的活性测定，验证活性位点中存在两个功能不同的口袋。
核心内容
该研究以玉米倍半萜合酶TPS4为对象，探究其活性位点结构如何控制复杂多步碳正离子反应并生成多种产物。基于TEAS晶体结构进行同源建模，对底物、碳正离子中间体及产物开展分子对接，同时结合定点突变与两种底物活性测定，提出并验证TPS4活性位点被G2螺旋分为两个功能口袋的模型。研究发现，野生型TPS4以(E,E)-FPP为底物可产生14种单环和双环倍半萜烯，活性位点空腔约15×12×10 Å。突变实验表明，Y528参与FPP异构化或早期步骤，Y382参与口袋II中的第二次环化，T301W对(E,E)-FPP完全失活但对(Z,E)-FPP保留10%野生型活性且产物谱改变。据此模型，口袋I催化底物结合、异构化及第一次环化至双香叶基阳离子，口袋II催化第二次环化生成双环产物，中间体通过构象变化在口袋间转移。该发现揭示了萜烯合酶通过活性位点亚结构调控中间体构象进而产生多样产物的新机制，为萜烯合酶的理性工程改造提供了理论基础。
创新点
首次提出并验证TPS4活性位点被G2螺旋分为两个功能口袋：口袋I催化反应早期步骤（底物结合、异构化、环化生成双环化合物前的单环双香叶基阳离子），口袋II催化第二次环化生成双环产物；双香叶基阳离子通过构象变化从口袋I转移到口袋II，从而形成多产物谱。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 倍半萜生物合成 | tps4-B73 (AY518310) | TPS4（玉米倍半萜合酶） | 催化 | 野生型酶，催化FPP生成14种倍半萜烯产物 |
| Escherichia coli | 倍半萜生物合成 | tps4突变体（Y528F, Y528L, Y528S, D532N, N452D, N452L, Y382F, Y382L, Y382S, E277Q, T301W, T305F, L413A, T301W/L413A） | TPS4突变体蛋白 | 催化 | 定点突变分析活性位点不同口袋的功能 |
| — | 倍半萜生物合成 | TEAS（5-epi-aristolochene synthase） | TEAS | 催化 | 作为同源建模模板，与TPS4有53%序列相似性 |
关键发现
- 野生型TPS4以(E,E)-FPP为底物可产生14种单环和双环倍半萜烯
- 活性位点空腔尺寸约15×12×10 Å，分为口袋I和II
- TPS4与TEAS的序列相似性为53%。定点突变显示：Y528F/Y528L/Y528S突变体对(E,E)-FPP几乎失活（仅痕量活性），但对(Z,E)-FPP仍有活性，说明Y528参与FPP异构化或早期步骤
- D532N对(E,E)-FPP完全失活，对(Z,E)-FPP产生野生型产物谱
- N452D无显著影响，N452L完全失活。Y382F/L/S突变导致主要双环产物7-epi-sesquithujene几乎完全消失（只产生无环和单环产物），对(Z,E)-FPP也如此，表明Y382参与口袋II中的第二次环化
- E277Q也减少7-epi-sesquithujene生成。T301W对(E,E)-FPP完全失活，对(Z,E)-FPP有10%野生型活性且产物谱改变
- T301W/L413A双突变恢复活性但双环产物仅痕量
- L413A单独突变减少双环产物并产生大量(E)-nerolidol。T305F对(E,E)-FPP无活性，对(Z,E)-FPP有活性且生成大量sesquisabinene A、sesquisabinene B和γ-curcumene。
研究结论
TPS4的活性位点由两个功能不同的口袋组成，口袋I负责底物结合、异构化和第一次环化直至形成双香叶基阳离子，口袋II负责随后的第二次环化生成双环倍半萜；双香叶基阳离子的构象变化使其从口袋I移至口袋II。该模型得到定点突变和底物类似物实验的支持，揭示了萜烯合酶通过活性位点亚结构调控中间体构象从而生成多样产物的新机制，为工程化改造萜烯合酶以生产特定产物提供了理论基础。