Isolation of cDNAs and functional characterisation of two multi-product terpene synthase enzymes from sandalwood, Santalum album L.

作者: Christopher G. Jones, Christopher I. Keeling, Emilio L. Ghisalberti, Elizabeth L. Barbour, Julie A. Plummer, Jörg Bohlmann
单位: School of Plant Biology (M084), Faculty of Natural and Agricultural Sciences, University of Western Australia; Michael Smith Laboratories, University of British Columbia; School of Biomedical, Biomolecular and Chemical Sciences (M313), Faculty of Life and Physical Sciences, University of Western Australia; Forest Products Commission of Western Australia
杂志: Archives of Biochemistry and Biophysics（2008）
DOI: 10.1016/j.abb.2008.05.008
所属领域: 代谢工程
关键词: Germacrene D-4-olSantalum albumSesquiterpeneTerpene synthaseα-Terpineol
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解决的核心问题

檀香（Santalum album）心材精油的倍半萜类化合物生物合成相关基因未知，特别是萜烯合酶（TPS）家族成员尚未被克隆和功能表征。

研究策略

利用简并引物PCR从檀香基因组DNA中扩增TPS片段，通过RACE获取全长cDNA；在大肠杆菌中异源表达重组蛋白，以GPP和FPP为底物进行体外酶活测定，采用GC-MS和GC-FID分析产物谱。

研究路线图

100%

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核心内容

本研究首次从檀香（Santalum album）中克隆并功能表征了两个多产物萜烯合酶基因SamonoTPS1和SasesquiTPS1。通过简并引物PCR和RACE技术获得全长cDNA，分别编码约66 kDa的单萜合酶和倍半萜合酶。体外酶活测定显示，SamonoTPS1以GPP为底物时主要生成(+)-α-松油醇（44.0%）和(-)-柠檬烯（33.6%），另有少量芳樟醇、月桂烯等副产物；SasesquiTPS1以FPP为底物时主要生成germacrene D-4-ol（38.9%）和helminthogermacrene（29.4%），热进样条件下β-榄香烯比例升至37.6%。此外，SasesquiTPS1在Mn²⁺条件下总产率较Mg²⁺降低近10倍。尽管这些产物在蒸馏檀香油中含量甚微，但该工作首次从檀香科植物中鉴定出多产物TPS家族成员，为后续解析檀香心材精油生物合成通路及发现关键P450酶奠定了基础。

创新点

首次从檀香科（Santalaceae）植物中克隆并功能表征了两个多产物萜烯合酶基因SamonoTPS1和SasesquiTPS1，分别鉴定为单萜合酶和倍半萜合酶，并解析了其复杂产物谱。

研究对象（2）

底盘细胞	代谢通路	基因	蛋白	功能	说明
Escherichia coli C41(DE3)	单萜生物合成	SamonoTPS1	SamonoTPS1	催化	异源表达重组单萜合酶，以GPP为底物生成(+)-α-松油醇、(-)-柠檬烯等多种单萜产物
Escherichia coli C41(DE3)	倍半萜生物合成	SasesquiTPS1	SasesquiTPS1	催化	异源表达重组倍半萜合酶，以FPP为底物生成germacrene D-4-ol、helminthogermacrene等倍半萜产物

关键发现

SamonoTPS1 cDNA长1731 bp，SasesquiTPS1 cDNA长1680 bp，重组蛋白约66 kDa。SamonoTPS1以GPP为底物时主要产物为(+)-α-松油醇（44.0%）、(-)-柠檬烯（33.6%），另含(E)-香叶醇（5.9%）、芳樟醇（5.0%）、月桂烯（3.4%）、(-)-α-蒎烯（3.3%）、(+)-桧烯（3.0%）和α-松油烯（1.6%）（Mn2+条件）
Mg2+条件下比例略有变化。SasesquiTPS1以FPP为底物（冷柱上样）时主要产物为germacrene D-4-ol（38.9%）和helminthogermacrene（29.4%），还有γ-muurolene（11.4%）、α-bulnesene（10.0%）、α-蛇床烯（3.4%）、β-蛇床烯（1.8%）、α-蛇麻烯（2.2%）和E-橙花叔醇（2.5%）
热进样时β-榄香烯占37.6%。SasesquiTPS1在Mn2+条件下总产率比Mg2+降低近10倍。SamonoTPS1以FPP为底物仅产生微量β-没药烯，SasesquiTPS1以GPP为底物仅产生微量芳樟醇。檀香心材含油量可达6%干重。

研究结论

本研究首次从檀香中克隆并功能表征了两个多产物萜烯合酶（单萜合酶SamonoTPS1和倍半萜合酶SasesquiTPS1），尽管其产物在蒸馏檀香油中含量甚微，但为后续鉴别檀香心材精油生物合成中的其他TPS和细胞色素P450酶奠定了基础。