Taxol biosynthesis: Identification and characterization of two acetyl CoA: taxoid-O-acetyl transferases that divert pathway flux away from Taxol production *
- 作者
- Daniela Hampel, Christopher J.D. Mau, Rodney B. Croteau
- 单位
- Institute of Biological Chemistry, Washington State University, Pullman, WA 99164-6340, USA
- 杂志
- Archives of Biochemistry and Biophysics（2009）
- DOI
- 10.1016/j.abb.2009.05.018
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
紫杉醇生物合成中，存在大量旁路代谢物将途径通量从目标药物分流。本文旨在鉴定和表征两个新的乙酰辅酶A:紫杉烷-O-乙酰转移酶（TAX9和TAX14），它们可能参与旁路代谢，从而为通过调控这些酶来提高紫杉醇产量提供靶点。
研究策略
从已获得的紫杉酰基/芳基转移酶 cDNA 文库中筛选未定义克隆，在 E. coli 中异源表达并纯化重组酶；利用放射性标记乙酰CoA和合成底物进行功能筛选；通过NMR和LC-MS鉴定产物结构；测定pH最适值、动力学常数和区域选择性，并与已知紫杉醇途径乙酰转移酶比较序列和功能。
核心内容
该研究从紫杉酰基/芳基转移酶cDNA文库中筛选并异源表达了两个新的乙酰辅酶A:紫杉烷-O-乙酰转移酶TAX9和TAX14，通过放射性标记底物筛选、NMR和LC-MS结构鉴定及酶动力学分析，发现二者专门催化紫杉烷多醇底物的C9α或C10β羟基乙酰化，且区域选择性随pH变化，最终将途径通量引向taxusin等副产物而非紫杉醇。TAX14对该底物的KM为19.5 μM，而TAX9为400 μM，转换数约0.9–1.5 s⁻¹；两种酶均不能乙酰化C5α或C13α羟基，且在碱性pH下更倾向生成taxusin。序列比较显示TAX9与TAX14相似性73%，但与已知紫杉醇途径乙酰转移酶的功能差异无法从一级结构预测。该工作首次鉴定了紫杉醇生物合成中的旁路乙酰转移酶，它们通过阻止C9位氧化为紫杉醇所需的酮基而分流通量，为通过基因改造减少副产物、提高紫杉醇产量提供了明确靶点。
创新点
首次鉴定出两个专门作用于部分乙酰化紫杉烷多醇、将紫杉醇合成途径引向旁路代谢物（如taxusin）的乙酰转移酶；发现其9α/10β区域选择性随pH变化；通过序列比较证实该酶家族的一级结构无法预示其在紫杉烷代谢中的具体功能。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) codon+ | Taxol生物合成旁路代谢（taxusin合成） | TAX9 | TAX9（taxoid-O-acetyl transferase 9） | 催化 | 重组酶；以taxadien-5α,13α-diacetoxy-9α,10β-diol为底物时，主要乙酰化C10β（中性pH）或C9α（碱性pH），最终生成taxusin；pH最适7.25 |
| Escherichia coli BL21(DE3) codon+ | Taxol生物合成旁路代谢（taxusin合成） | TAX14 | TAX14（taxoid-O-acetyl transferase 14） | 催化 | 重组酶；中性pH下优先乙酰化C9α；pH 9.0时C9α和C10β乙酰化速率相当；pH最适7.5 |
| Taxus spp.（基因来源） | Taxol生物合成 | TAX19 | TAX19（taxadien-5α-ol O-乙酰转移酶） | 催化 | 已知参与Taxol途径的C5α乙酰化，用作序列和功能比较；TAX14与TAX19序列同一性87%，相似性93% |
关键发现
- TAX9 和 TAX14 重组酶催化 taxadien-5α,13α-diacetoxy-9α,10β-diol 的 C9α 或 C10β 乙酰化，最终生成 taxusin；TAX9 的 pH 最适值为
- 25，TAX14 为
- 5，半最大活性对应 pH 约
- 0 和
- 3；以该底物计时，TAX14 的 KM=19.5 μM，TAX9 的 KM=400 μM，转换数约
- 9–1.5 s-1；TAX9 对 13-acetyl-9-dihydro-baccatin III 的 KM=180 μM，速率降低约10倍；TAX9 与 TAX14 序列相似性73%、同一性62%，TAX14 与 TAX19 同一性87%、相似性93%；两种酶均不能乙酰化 C5α 或 C13α 羟基；碱性 pH 下产物分布改变，pH9.5 时 TAX9 主要生成 taxusin。
研究结论
TAX9 和 TAX14 是紫杉醇生物合成中的'旁路'乙酰转移酶，优先作用于已在 C13 位乙酰化、无法继续生成紫杉醇的紫杉烷多醇，通过乙酰化 C9α 和 C10β 羟基（并可进一步全乙酰化）生成 taxusin 等副产物，从而分流途径通量。由于 TAX9 和 TAX14 可阻止 C9 氧化为酮基（紫杉醇所需），它们可作为改造靶点来减少旁路代谢、提高紫杉醇产量。