Development of next generation of therapeutic IFN-α2b via genetic code expansion
- 作者
- Bo Zhang, Huan Xu, Jingxian Chen, Yongxiang Zheng, Yiming Wu, Longlong Si, Ling Wu, Chuanling Zhang, Gang Xia, Lihe Zhang, Demin Zhou
- 单位
- State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs, School of Pharmaceutical Sciences, Peking University, Beijing 100191, China
- 杂志
- Acta Biomaterialia（2015）
- DOI
- 10.1016/j.actbio.2015.03.002
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
克服市售IFN-α2b PEG化产品（如PEG-INTRON、Pegasys）的异质性，优化PEG修饰的位点与大小，获得均一、单一、高活性且长循环的治疗性IFN-α2b
研究策略
利用遗传密码扩展技术，在IFN-α2b表面指定位置定点掺入含叠氮基的非天然氨基酸NAEK，再通过无铜点击化学（菌株促进的炔-叠氮环加成）将不同大小PEG正交偶联到目标位点，实现位点特异性和化学计量学PEG化，并系统评价不同位点/不同大小PEG偶联物的活性与药代性质
核心内容
针对市售PEG化干扰素产品异质性高、位点随机、活性损失大的问题，该研究利用遗传密码扩展技术在IFN-α2b表面指定位置定点掺入含叠氮基的非天然氨基酸NAEK，再通过无铜点击化学将不同分子量（5–40 kDa）的PEG正交偶联至目标位点，从而获得单一均一（纯度>95%）的位点特异性PEG化偶联物。在OrigamiB(DE3)菌株中优化可溶表达产量约50 mg/L，比BL21(DE3)高约3倍。系统构效关系筛选表明，单PEG化优于多PEG化，其中H34-20kDa、A74-10kDa、E107-10kDa组合平衡了活性与药代性质：最优偶联物保留约40%的野生型抗增殖活性，约为PEG-INTRON的2倍；大鼠静脉半衰期由野生型的1.5小时延长至约6.5小时（10 kDa PEG化），皮下半衰期随PEG增大最多延长48倍。双PEG化虽提高蛋白酶稳定性并延长半衰期，但大分子量双修饰导致活性下降约4倍。该工作建立了基于遗传密码扩展的通用蛋白定点PEG化平台，为开发下一代治疗性细胞因子及其他蛋白药物提供了新策略。
创新点
1. 建立基于遗传密码扩展的IFN-α2b任意位点PEG化平台，产物单一均一（纯度>95%）；2. 使用稳定的三唑连接键替代易水解/不稳定的马来酰亚胺或琥珀酰亚胺碳酸酯连接；3. 通过系统构效关系筛选出最优位点-分子量组合：H34-20kDa、A74-10kDa、E107-10kDa
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli OrigamiB(DE3) | 重组蛋白表达 | — | — | 能量供给 | 用于表达可溶性IFN-α2b，摇瓶产量约50 mg/L，是BL21(DE3)的约3倍，可溶性比例约60%。 |
| — | 干扰素信号通路 | IFNA2 (IFN-α2b) | IFN-α2b | 调控 | 治疗性蛋白，通过位点特异性PEG化改善药代性质。 |
| — | 遗传密码扩展 | NAEK-specific aminoacyl-tRNA synthetase (aRS) | NAEK特异性氨酰-tRNA合成酶 | 催化 | 来自pSURAR-YAV质粒，催化NAEK与tRNA的连接，实现琥珀密码子（UAG）的抑制。 |
| — | 遗传密码扩展 | tRNA(PolyI) (amber suppressor tRNA) | 琥珀抑制tRNA | 转运 | 识别UAG终止密码子，将NAEK转运至核糖体。 |
关键发现
- ['Optimized expression of soluble IFN-α2b in OrigamiB(DE3) with yield ~50 mg/L in shake flasks, about 3-fold higher than BL21(DE3)/BL21(AI), with ~60% solubility vs >95% insoluble in other strains.', 'Site-specific incorporation of NAEK produced mutant IFN-α2b at ~30 mg/L; incorporation efficiency was >95% at A74 and E113, <10% at R125 and C29.', 'NAEK incorporation at tolerant sites (P4, H34, E41, E51, A74, E107, L110, M111, E113, P137) preserved anti-proliferative activity with IC50 14–26 pg/ml vs
- 2±5.6 pg/ml for WT.', 'PEGylation via NAEK gave ~95% single mono-PEGylated conjugate, with reaction complete within 1 h, independent of temperature (4–37°C) and pH (2–12).', 'All 10-kDa PEG positional isomers had preserved secondary structure; receptor binding KD increased 3–10 fold (e.g., P137 40 nM vs WT 4 nM), while PEG-INTRON was 29 nM.', 'Mono-PEGylates at H34, A74 and E107 with 20-, 10- and 10-kDa PEG respectively showed ~40% anti-proliferative activity of WT, two-fold higher than PEG-INTRON; H34-10K antiviral activity was
- 9×10^7 IU/mg vs PEG-INTRON
- 9×10^7 IU/mg.', 'PK in rats: i.v. half-life extended from
- 5 h (WT) to ~6.5 h for 10-kDa PEGylated isomers; AUC improved from
- 56 to ~30 μg/ml·h.', 'For H34 site, half-lives with 5-, 10-, 20-, 40-kDa PEG were
- 6 h, respectively; s.c. half-life extended 4-, 14-, 34-, 48-fold over WT.', 'Dual-PEGylation at H34 and E107 increased trypsin resistance (30% remaining vs 5–10% for mono-PEG) and doubled half-life over mono-PEG of same PEG size, but large dual-PEG (2×20 kDa) caused ~4-fold loss of activity vs mono-20 kDa.', 'The best candidates were H34-20K, A74-10K and E107-10K, balancing bioactivity and PK.']
研究结论
通过遗传密码扩展实现了IFN-α2b的位点特异性PEG化，能够制备单一均一偶联物，并系统优化了PEG位点和大小；单PEG化优于多PEG化，H34-20kDa、A74-10kDa、E107-10kDa为潜在最佳治疗候选，为下一代治疗性IFN-α2b和其他蛋白药物的开发提供了平台。