Molecular Characterization and Functional Analysis of Cytochrome b5 Reductase (CBR) Encoding Genes from the Carotenogenic Yeast Xanthophyllomyces dendrorhous
- 作者
- Maria Soledad Gutiérrez, María Cecilia Rojas, Dionisia Sepúlveda, Marcelo Baeza, Victor Cifuentes, Jennifer Alcaino
- 单位
- 智利大学科学学院生态学系；智利大学科学学院化学系
- 杂志
- PLoS ONE（2015）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0140424
- 所属领域
- 代谢工程
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解决的核心问题
在产类胡萝卜素酵母Xanthophyllomyces dendrorhous中，细胞色素P450还原酶(CrtR)基因突变后菌株仍然存活，说明存在替代的P450电子供体。本文旨在鉴定和表征CBR-CYB5通路是否作为替代电子供体参与麦角固醇和类胡萝卜素生物合成。
研究策略
通过BLAST分析从基因组和转录组序列中鉴定CBR和CYB5基因，构建CBR.1和CBR.2基因敲除突变株，比较野生型、crtR突变株和cbr突变株在类胡萝卜素和固醇产量、微粒体细胞色素c还原酶活性及基因转录水平上的差异，从而评估CBR-CYB5通路的功能。
核心内容
本研究在产类胡萝卜素酵母Xanthophyllomyces dendrorhous中鉴定并功能分析了两个细胞色素b5还原酶基因CBR.1、CBR.2及一个CYB5基因。通过基因敲除构建了cbr.1和cbr.2单突变株，发现cbr.1突变株72小时类胡萝卜素产量达224.2 μg/g干重，约为野生型的3.6倍，而cbr.2突变株无显著差异；各菌株总固醇含量和麦角固醇比例相近。在P450还原酶CrtR缺失的突变株中，NADH依赖性细胞色素c还原活性较野生型高约2倍，且CBR.1和CYB5转录水平显著上调，同时固醇谱中出现与cyp61突变株相同的峰，表明CYP61活性受损。这些结果证明CBR.1-CYB5通路可作为P450酶的替代电子供体参与麦角固醇生物合成，在CrtR缺失时被部分补偿性上调，但不足以支持虾青素合成，说明CrtR仍是主要的P450还原酶。该发现揭示了类胡萝卜素酵母中P450电子传递的冗余机制，为理解麦角固醇与类胡萝卜素合成通路的调控关系提供了新视角。
创新点
首次在X. dendrorhous中鉴定并功能分析了两个CBR基因（CBR.1和CBR.2）和一个CYB5基因；通过基因敲除和酶活实验证明CBR.1-CYB5通路作为P450酶的替代电子供体参与麦角固醇合成；发现crtR突变株中CBR.1和CYB5转录水平上调，提示存在补偿机制。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Xanthophyllomyces dendrorhous | 类胡萝卜素生物合成 | crtS | CrtS | 催化 | 虾青素合酶，P450单加氧酶，催化β-胡萝卜素转化为虾青素 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous | 类胡萝卜素/麦角固醇生物合成 | crtR | CrtR | 催化 | 细胞色素P450还原酶，NADPH依赖，为P450提供电子 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous | 麦角固醇生物合成 | CYP51 | CYP51 | 催化 | 甾醇14α-去甲基化酶 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous | 麦角固醇生物合成 | CYP61 | CYP61 | 催化 | C-22甾醇去饱和酶 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous | 麦角固醇生物合成（P450电子传递） | CBR.1 | CBR.1 | 催化 | 细胞色素b5还原酶，NADH依赖，与CYB5构成替代电子供体通路 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous | — | CBR.2 | CBR.2 | 催化 | 预测位于线粒体膜，可能不参与内质网P450系统 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous | 麦角固醇生物合成（P450电子传递） | CYB5 | CYB5 | 能量供给 | 细胞色素b5，作为电子载体为P450提供电子 |
关键发现
- 本研究鉴定到两个CBR基因（CBR.1和CBR.2）和一个CYB5基因。CBR.1基因ORF 870 bp，编码289 aa（31.48 kDa）
- CBR.2 ORF 993 bp，编码330 aa（35.35 kDa）
- CYB5 ORF 444 bp，编码148 aa（16.07 kDa）。构建了cbr.1和cbr.2单基因敲除突变株，cbr.1突变株在72 h时类胡萝卜素产量达224.2±4.5 μg/g干重，约为野生型（62.4±3.5 μg/g）的3.6倍
- cbr.2突变株无显著差异。各菌株的总固醇含量相近（36 h约5.5-7.8 mg/g，72 h约3.9-4.2 mg/g），cbr突变株与野生型的麦角固醇比例均约98%。crtR突变株（CBSTr）不产虾青素但积累β-胡萝卜素，其72 h类胡萝卜素产量为82.9±4.4 μg/g
- 其固醇谱中除麦角固醇外还出现与cyp61突变株相同的两个峰，表明CYP61活性受损。微粒体酶活测定显示野生型以NADPH还原细胞色素c活性为主，而crtR突变株NADH活性较野生型高约2倍、NADPH活性低约3倍
- cbr.1突变株的NADH依赖性活性降低。RT-qPCR显示crtR突变株中CBR.1和CYB5的转录水平在72 h时显著高于野生型，说明CBR.1-CYB5通路作为替代电子供体被上调。
研究结论
CBR.1-CYB5通路作为X. dendrorhous中P450酶的替代电子供体，参与麦角固醇生物合成；CrtR仍是主要的P450还原酶，但在缺乏CrtR时，CBR.1-CYB5可部分补偿其功能，但不足以支持虾青素合成。