Genetic and Phenotypic Comparison of Facultative Methylotrophy between Methylobacterium extorquens Strains PA1 and AM1
- 作者
- Dipti D. Nayak, Christopher J. Marx
- 单位
- Organismic and Evolutionary Biology, Harvard University; Faculty of Arts and Sciences Center for Systems Biology, Harvard University; Department of Biological Sciences, University of Idaho; Institute for Bioinformatics and Evolutionary Studies, University of Idaho
- 杂志
- PLoS ONE（2014）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0107887
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
比较兼性甲基营养菌Methylobacterium extorquens PA1与模式菌株AM1在遗传和表型上的差异，验证AM1数十年积累的甲基营养代谢知识是否适用于基因组更加精简、未经长期实验室驯化的PA1，并评估PA1作为替代模式菌株的可行性。
研究策略
对PA1和AM1进行全基因组水平的甲基营养基因比较；利用自动化高通量培养平台定量比较两菌株在多种C1和多碳底物上的生长速率和产量；在PA1中系统性敲除甲基营养各模块的关键基因（mxa操纵子、fae、mptG、ftfL、glyA、hprA等），并分析突变株在单一及混合底物上的生长表型。
核心内容
该研究系统比较了兼性甲基营养菌Methylobacterium extorquens PA1与模式菌株AM1在遗传与表型上的差异。通过全基因组比对发现两菌株共有4260个编码序列，已知甲基营养基因同源性极高，其中62个基因氨基酸同一性超过99%。利用高通量培养平台定量测定发现，PA1在甲醇和甲酸盐上生长比AM1快10-15%，产量高50-75%，且能利用乙醇（倍增时间4.39小时）而AM1几乎不能生长；但在甲胺和甜菜碱上AM1表现更好。通过系统性敲除甲基营养各模块关键基因，构建了PA1突变体库，发现ΔmptG和Δfae突变体不能在甲醇上生长，ΔftfL突变体与AM1不同在多碳底物上无生长优势，ΔglyA突变体完全不能利用乙醇。在混合底物实验中，PA1在甲醇加琥珀酸上比单独琥珀酸生长快16%、产量高35%。这些结果表明PA1的甲基营养网络与AM1功能高度一致，但其基因组精简、生长性能更优，可作为替代模式菌株，同时揭示出若干与多碳代谢及C1/多碳共利用相关的调控差异。
创新点
首次系统比较了M. extorquens PA1与AM1的甲基营养遗传网络和定量生长表型；发现PA1基因组精简（单复制子、仅20个IS元件）且生长更快、产量更高；构建了PA1的多基因敲除突变体库，揭示出若干与AM1不同的意外生长表型；证明PA1可作为研究好氧甲基营养的替代模型系统。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Methylobacterium extorquens PA1 | 甲醇氧化 | mxa operon (mxaFI等) | 甲醇脱氢酶 MxaFI | 催化 | 编码甲醇脱氢酶及其辅助蛋白，删除后导致甲醇和乙醇严重生长缺陷 |
| Methylobacterium extorquens PA1 | 甲醛氧化（H4MPT依赖途径） | fae | 甲醛激活酶 | 催化 | 催化甲醛与H4MPT缩合，删除后不能在甲醇上生长，在多碳底物上生长变慢 |
| Methylobacterium extorquens PA1 | H4MPT生物合成 | mptG | 核糖呋喃氨基苯5'-磷酸合成酶 | 催化 | 催化H4MPT生物合成第一步，删除后不能在甲醇上生长，在丙酮酸上生长慢25% |
| Methylobacterium extorquens PA1 | 甲酸同化（H4F依赖途径） | ftfL | 甲酸四氢叶酸连接酶 | 催化 | 催化甲酸与H4F连接，删除后不能在甲醇或甲酸盐上生长 |
| Methylobacterium extorquens PA1 | 丝氨酸循环 | glyA | 丝氨酸羟甲基转移酶 | 催化 | 删除后不能在C1底物上生长，且不能利用乙醇，在丙酮酸上极慢，琥珀酸上慢10% |
| Methylobacterium extorquens PA1 | 丝氨酸循环 | hprA | 羟基丙酮酸还原酶 | 催化 | 删除后不能在C1底物上生长，但在多碳底物上生长正常 |
| Methylobacterium extorquens PA1 | 甲醛氧化（H4MPT依赖途径） | mch | 亚甲基-H4MPT环化水解酶 | 催化 | 仅能在ΔmptG背景下删除，表明晚期阻断导致有毒中间产物积累 |
| Methylobacterium extorquens PA1 | 甲醛氧化（H4MPT依赖途径） | fhcBACD | 甲酰转移酶/水解酶复合物 | 催化 | 仅能在ΔmptG背景下删除，参与甲酸生成 |
| Methylobacterium extorquens AM1 | 纤维素合成 | cel locus | 纤维素合成相关蛋白 | 区室化 | Δcel突变体用于防止细胞聚集，使生长测量更准确，两菌株均使用该背景 |
| Methylobacterium extorquens PA1 | 甲醇氧化（可能的辅助途径） | xoxF (推测) | XoxF（MxaFI同源物） | 调控 | 在Δmxa突变体中，混合底物上仍比琥珀酸单独快11%，可能由XoxF介导甲醇氧化或感知 |
关键发现
- PA1与AM1共有4260个编码序列（氨基酸同一性>30%），90个已知甲基营养基因中62个同一性>99%，其余28个≥95%
- PA1在甲醇和甲酸盐上生长比AM1快10-15%，产量高50-75%
- 在乙醇上PA1倍增时间为4.39 h，而AM1几乎不能生长（低于检测限约17.5 h）
- 在多碳有机酸上PA1生长快5-25%，产量高12-25%
- 但在甲胺和甜菜碱上AM1生长更快，PA1在甲胺上生长极慢且低于检测限。Δmxa突变体在甲醇和乙醇上均严重生长缺陷
- ΔmptG和Δfae突变体不能在甲醇上生长，且ΔmptG在丙酮酸上生长慢25%（p<0.001），Δfae慢7%（p<0.01）
- ΔftfL突变体不能在甲醇或甲酸盐上生长，但与AM1不同，在多碳底物上无显著生长优势
- ΔglyA突变体不能在多种C1底物上生长，且完全不能利用乙醇，在丙酮酸上极慢，在琥珀酸上生长慢10%（p<0.01）
- ΔhprA突变体不能在C1底物上生长，但在多碳底物上生长与野生型一致
- PA1在甲醇+琥珀酸混合底物上比单独琥珀酸生长快16%、产量高35%
- Δmxa突变体在混合底物上比单独琥珀酸生长快11%（p<0.001），但产量与预期一致。
研究结论
M. extorquens PA1的甲基营养代谢网络在功能上与AM1高度一致，AM1的甲基营养知识基本可转移到PA1。但两菌株在特定底物（如乙醇、甲胺、甜菜碱）上的生长差异反映了生态位适应或调控差异。PA1基因组精简且生长性能优越，是研究好氧甲基营养的替代模式菌株，并揭示了若干与多碳代谢和C1/多碳共利用相关的未解调控问题。