RNA interference targeting CYP76AH1 in hairy roots of Salvia miltiorrhiza reveals its key role in the biosynthetic pathway of tanshinones
- 作者
- Ying Ma, Xiao-Hui Ma, Fan-Yun Meng, Zhi-Lai Zhan, Juan Guo, Lu-Qi Huang
- 单位
- Area Major Laboratory of Traditional Chinese Medicine, Beijing Normal University, Beijing 100875, China; State Key Laboratory Breeding Base of Dao-di Herbs, National Resource Center for Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China; Pharmacy College, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China
- 杂志
- Biochemical and Biophysical Research Communications（2016）
- DOI
- 10.1016/j.bbrc.2016.06.036
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
验证CYP76AH1在丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根中对丹参酮生物合成的体内功能，明确其是否可作为代谢工程改造的靶点。
研究策略
构建CYP76AH1的RNA干扰（RNAi）载体，通过发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）C58C1转化丹参叶片获得转基因毛状根；利用qRT-PCR检测靶基因及非靶基因的转录水平；采用UPLC-QTOF/MS和GC-MS分析丹参酮及其中间产物的含量变化。
核心内容
为验证丹参酮生物合成途径中CYP76AH1的体内功能，该研究构建了CYP76AH1的RNA干扰载体，通过发根农杆菌C58C1转化丹参叶片获得转基因毛状根，利用qRT-PCR检测转录水平，并结合UPLC-QTOF/MS和GC-MS分析代谢产物变化。结果显示，CYP76AH1转录水平降至对照的37.6%，丹参酮IIA、隐丹参酮和丹参酮I含量分别降至对照的56.8%、61.7%和50.0%，底物mil tiradiene积累提高12.7倍，产物ferruginol含量降至37.4%。多个下游中间产物如11,20-二羟基ferruginol和11,20-二羟基sugiol分别降至5.2%和7.2%，而CYP76AH3和CYP76AK1转录未受显著抑制。代谢组学分析发现8个显著减少的离子峰且无其他底物累积。结果表明CYP76AH1催化mil tiradiene生成ferruginol，是丹参酮生物合成的关键酶，可作为代谢工程改造的重要靶点。
创新点
首次在丹参毛状根中构建CYP76AH1 RNAi体系，在体内证实了CYP76AH1催化mil tiradiene生成ferruginol的活性，并证明其在丹参酮生物合成中的关键作用；通过代谢组学分析发现8个显著减少的候选下游中间产物离子峰。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | 丹参酮生物合成途径 | CYP76AH1 | CYP76AH1 | 催化 | 催化mil tiradiene转化为ferruginol，RNAi沉默后导致丹参酮合成受阻。 |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | 丹参酮生物合成途径 | CYP76AH3 | CYP76AH3 | 催化 | 与CYP76AH1序列相似性>80%，RNAi后转录水平无显著下降，未受共抑制。 |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | 丹参酮生物合成途径 | CYP76AK1 | CYP76AK1 | 催化 | 序列相似性<59%，RNAi后转录水平无显著变化，表明干扰特异性。 |
关键发现
- RNAi沉默CYP76AH1后，其转录水平降至对照的37.6%
- 丹参酮IIA、隐丹参酮和丹参酮I含量分别降至对照的56.8%、61.7%和50.0%
- 底物mil tiradiene积累提高12.7倍
- 产物ferruginol含量降至37.4%
- 下游中间产物sugiol、11-羟基sugiol、11-羟基ferruginol、11,20-二羟基ferruginol、11,20-二羟基sugiol、10-羟甲基四氢丹参酮和mil tirone分别降至42.8%、17.5%、12.5%、5.2%、7.2%、10.5%和21.6%。CYP76AH3和CYP76AK1的转录水平未受显著抑制。OPLS-DA分析发现8个显著减少的离子峰，且未检测到除mil tiradiene外其他累积底物。
研究结论
CYP76AH1在丹参酮生物合成中起关键作用，催化mil tiradiene转化为ferruginol，是丹参酮生物合成途径的关键酶，可作为丹参酮代谢工程改造的重要靶点。