Functional characterization and transient expression manipulation of a new sesquiterpene synthase involved in β-caryophyllene accumulation in Ocimum
- 作者
- Ramesha H. Jayaramaiah, Atul Anand, Supriya D. Beedkar, Bhushan B. Dholakia, Sachin A. Punekar, Raviraj M. Kalunke, Wasudeo N. Gade, Hirekodathakallu V. Thulasiram, Ashok P. Giri
- 单位
- Division of Biochemical Sciences, CSIR-National Chemical Laboratory, Pune 411008, Maharashtra, India; Division of Organic Chemistry, CSIR-National Chemical Laboratory, Pune 411008, Maharashtra, India; Department of Biotechnology, Savitribai Phule Pune University, Pune 411007, Maharashtra, India; Biospheres, Eshwari, 52/403, Lakshminagar, Parvati, Pune 411009, Maharashtra, India; CSIR-Institute of Genomics and Integrative Biology, Mall Road, New Delhi 110007, India
- 杂志
- Biochemical and Biophysical Research Communications（2016）
- DOI
- 10.1016/j.bbrc.2016.03.090
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
Ocimum属植物中β-石竹烯（β-caryophyllene）的生物合成关键酶尚不清楚，缺乏对其合成酶基因的分子表征和功能验证。
研究策略
从Ocimum kilimandscharicum转录组中鉴定候选倍半萜合酶基因，克隆得到OkBCS，进行异源表达和生化表征；分析不同Ocimum物种组织中OkBCS表达与β-石竹烯积累的相关性；利用农杆菌介导的瞬时过表达和RNAi沉默验证OkBCS在β-石竹烯生物合成中的功能。
核心内容
该研究从Ocimum kilimandscharicum转录组中鉴定并克隆了一个新的倍半萜合酶基因OkBCS，其开放阅读框长1,629 bp，编码542个氨基酸。将OkBCS在大肠杆菌中异源表达后，重组酶以法尼基焦磷酸为底物催化生成以β-石竹烯为主（占94%）和少量α-蛇麻烯的产物，酶动力学参数Km为125.5 μM，kcat为4.06 s⁻¹。在五种Ocimum物种中，OkBCS表达水平与β-石竹烯积累呈正相关，其中O. tenuiflorum花序中的相对丰度最高达18%。为进一步验证其功能，研究者建立了农杆菌介导的Ocimum瞬时表达系统。瞬时沉默OkBCS后，4天时局部叶转录本减少95%，β-石竹烯水平下降20%；瞬时过表达则使转录本增加400%，8天时β-石竹烯在局部和系统叶中分别增加52%和56%。这些结果直接证明了OkBCS是催化β-石竹烯合成的关键酶，为利用该基因增强作物抗虫性和药用价值提供了依据。
创新点
首次从Ocimum kilimandscharicum中克隆并功能表征了β-石竹烯合酶基因OkBCS；建立了基于农杆菌浸润的Ocimum瞬时表达系统，用于基因过表达和沉默；通过瞬时操纵OkBCS表达直接证明其调控β-石竹烯积累的作用。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli Rosetta 2 (DE3) | 倍半萜生物合成 | OkBCS (KP226502) | β-caryophyllene synthase (OkBCS) | 催化 | 用于异源表达和纯化重组酶，进行生化表征及动力学分析 |
| Ocimum kilimandscharicum | 倍半萜生物合成 | OkBCS | β-caryophyllene synthase (OkBCS) | 催化 | 通过农杆菌介导的瞬时过表达和RNAi沉默，验证OkBCS在β-石竹烯积累中的功能 |
关键发现
- OkBCS基因开放阅读框长1,629 bp，编码542个氨基酸，蛋白分子量63.63 kDa，pI 5.66
- 重组OkBCS以FPP为底物，产物中β-石竹烯占94%，α-蛇麻烯占6%
- 酶动力学参数Km=125.5 μM，Vmax=2.55 μM·s⁻¹，kcat=4.06 s⁻¹
- 五种Ocimum物种中，O. tenuiflorum花序β-石竹烯相对丰度最高达18%，O. kilimandscharicum和O. americanum约6%，O. gratissimum约2%，O. basilicum约1%
- 瞬时沉默OkBCS后，4天时系统叶和局部叶转录本分别减少95%和51%，β-石竹烯水平下降20%
- 瞬时过表达后，4天时局部叶转录本增加400%，8天时β-石竹烯在局部和系统叶分别增加52%和56%。
研究结论
OkBCS是Ocimum中催化FPP环化生成β-石竹烯的关键倍半萜合酶，其表达水平与β-石竹烯积累相关；瞬时表达操纵验证了OkBCS在β-石竹烯生物合成中的直接作用，并暗示其可用于增强作物抗虫性和药用价值。