Diversity of ABBA Phenyltransferases in Marine Streptomyces sp. CNQ-509: Promiscuous Enzymes for the Biosynthesis of Mixed Terpenoid Compounds
- 作者
- Franziska Leipoldt, Philipp Zeyhle, Andreas Kulik, Jörn Kalinowski, Lutz Heide, Leonard Kaysser
- 单位
- Pharmaceutical Biology, Pharmaceutical Institute, Eberhard Karls University Tübingen, Tübingen, Germany; German Centre for Infection Research (DZIF), Partner Site Tübingen, Tübingen, Germany; Microbial Biotechnology, Interfaculty Institute of Microbiology and Infection Medicine, Eberhard Karls University Tübingen, Tübingen, Germany; Microbial Genomics and Biotechnology, Center for Biotechnology, Bielefeld University, Bielefeld, Germany
- 杂志
- PLoS ONE（2015）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0143237
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
解析海洋链霉菌Streptomyces sp. CNQ-509中ABBA异戊烯基转移酶的多样性，发现具有宽泛底物特异性的新型生物催化酶，并阐明其在萜类杂合天然产物生物合成中的作用。
研究策略
对Streptomyces sp. CNQ-509进行基因组测序与生物信息学挖掘，鉴定到8个ABBA异戊烯基转移酶基因；在大肠杆菌中异源表达和纯化，通过体外酶活测定评估底物特异性、产物类型及镁离子依赖性，结合基因簇分析推测其生物学功能。
核心内容
对海洋链霉菌Streptomyces sp. CNQ-509进行基因组测序，获得约798万碱基的草图序列，并通过生物信息学挖掘鉴定到8个ABBA异戊烯基转移酶基因，其中7个编码酚/吩嗪型、1个编码吲哚型。将这些基因在大肠杆菌中异源表达并纯化后，通过体外酶活测定评估了底物特异性和辅因子需求。结果显示5个酶具有催化活性，其中CngP3表现出突出的底物杂泛性，对flaviolin与香叶基焦磷酸的组合活性高达9800 μmol产物·mol酶⁻¹·s⁻¹，并对多种芳香底物和异戊烯基供体均有催化能力。此外，CngP2、CngP3、CngP4和CngP6被证实为镁离子依赖型，加入EDTA后完全失活，其中CngP6虽序列预测为不依赖镁离子但实验证明其依赖。基因组中未发现甲羟戊酸途径基因，推测异戊烯基供体由MEP途径提供。该菌株是ABBA异戊烯基转移酶基因的丰富来源，CngP3因其高活性和宽泛底物范围，成为化学酶法合成异戊烯基化芳烃化合物的潜力工具，同时新发现的镁离子依赖型酶拓展了对该酶家族辅因子需求的认识。
创新点
首次报道一个菌株拥有如此高数量（8个）的ABBA异戊烯基转移酶基因；发现CngP3具有广泛的芳香底物和异戊烯基供体杂泛性，可作为化学酶法合成的候选工具；鉴定出四个新的镁离子依赖型ABBA异戊烯基转移酶（CngP2、CngP3、CngP4、CngP6），扩展了该酶家族对辅因子需求的认识；提出使用ABBA异戊烯基转移酶基因筛选作为鉴定产混合萜类化合物的放线菌的补充策略。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 萜类/异戊二烯生物合成（meroterpenoid biosynthesis） | AA958_30735 | CngP1 | 催化 | 来源于Streptomyces sp. CNQ-509的酚/吩嗪型ABBA异戊烯基转移酶，位于吩嗪生物合成基因簇中，但未检测到活性。 |
| Escherichia coli | 萜类/异戊二烯生物合成（meroterpenoid biosynthesis） | AA958_18620 | CngP2 | 催化 | 来源于Streptomyces sp. CNQ-509的酚/吩嗪型ABBA异戊烯基转移酶，镁离子依赖，对genistein、1,6-DHN、2,7-DHN具有催化活性。 |
| Escherichia coli | 萜类/异戊二烯生物合成（meroterpenoid biosynthesis） | AA958_24325 | CngP3 | 催化 | 来源于Streptomyces sp. CNQ-509的酚/吩嗪型ABBA异戊烯基转移酶，镁离子依赖，底物杂泛性广，推测参与debromomarinone生物合成。 |
| Escherichia coli | 萜类/异戊二烯生物合成（meroterpenoid biosynthesis） | AA958_24270 | CngP4 | 催化 | 来源于Streptomyces sp. CNQ-509的酚/吩嗪型ABBA异戊烯基转移酶，镁离子依赖，对2,7-DHN和dihydro-PCA具有催化活性。 |
| Escherichia coli | 萜类/异戊二烯生物合成（meroterpenoid biosynthesis） | AA958_12625 | CngP5 | 催化 | 来源于Streptomyces sp. CNQ-509的酚/吩嗪型ABBA异戊烯基转移酶，对1,6-DHN具有催化活性，可溶表达产量低（0.6 mg/L）。 |
| Escherichia coli | 萜类/异戊二烯生物合成（meroterpenoid biosynthesis） | AA958_12635 | CngP6 | 催化 | 来源于Streptomyces sp. CNQ-509的酚/吩嗪型ABBA异戊烯基转移酶，序列预测为镁离子不依赖但实验证明依赖，对genistein具有催化活性。 |
| Escherichia coli | 萜类/异戊二烯生物合成（meroterpenoid biosynthesis） | AA958_12645 | CngP7 | 催化 | 来源于Streptomyces sp. CNQ-509的酚/吩嗪型ABBA异戊烯基转移酶，未检测到活性。 |
| Escherichia coli | 萜类/异戊二烯生物合成（meroterpenoid biosynthesis） | AA958_07645 | CngP8 | 催化 | 来源于Streptomyces sp. CNQ-509的吲哚型ABBA异戊烯基转移酶，未检测到活性。 |
关键发现
- 基因组测序获得7,998,446 bp的草图序列，平均覆盖度87.7倍，GC含量73.1%，预测6,412个编码序列。鉴定到8个ABBA异戊烯基转移酶基因（AA958_30735, AA958_18620, AA958_24325, AA958_24270, AA958_12625, AA958_12635, AA958_12645, AA958_07645），其中7个编码酚/吩嗪型（CngP1-CngP7），1个编码吲哚型（CngP8）。5个酶（CngP2、CngP3、CngP4、CngP5、CngP6）表现出体外催化活性。CngP3对flaviolin + GPP的活性为9800 μmol产物·mol酶^-1·s^-1，对genistein + GPP为2500，对1,6-DHN + DMAPP为700，对1,6-DHN + GPP为1400，对2,7-DHN + GPP为300。CngP2对genistein + GPP为42，对1,6-DHN + GPP为72，对2,7-DHN + GPP为100。CngP6对genistein + GPP为30。CngP5对1,6-DHN + DMAPP为170。CngP4对dihydro-PCA + DMAPP为26。CngP2、CngP3、CngP4、CngP6均依赖镁离子，加入EDTA完全失活
- CngP6虽序列预测为镁离子不依赖但实验证明依赖。基因组中未发现甲羟戊酸途径基因，推测异戊烯基供体由MEP途径提供。
研究结论
Streptomyces sp. CNQ-509是ABBA异戊烯基转移酶基因的一个丰富来源，其编码的多种酶在体外表现出不同的底物选择性。其中CngP3具有突出的底物杂泛性和高催化活性，是化学酶法合成异戊烯基化芳烃化合物的有潜力生物催化剂。此外，四个新发现的镁离子依赖型ABBA异戊烯基转移酶拓展了对该酶家族辅因子依赖性的认识。这些发现为天然产物生物合成和合成生物学应用提供了新的酶资源。