Ketocarotenoid Production in Soybean Seeds through Metabolic Engineering
- 作者
- Emily C. Pierce, Peter R. LaFayette, María A. Ortega, Blake L. Joyce, Dean A. Kopsell, Wayne A. Parrott
- 单位
- Center for Applied Genetic Technologies and the Institute of Plant Breeding, Genetics, and Genomics, The University of Georgia, Athens, Georgia, United States of America; The School of Plant Sciences, BIO5 Institute, University of Arizona, Tucson, Arizona, United States of America; Plant Sciences Department, The University of Tennessee, Knoxville, Tennessee, United States of America
- 杂志
- PLoS ONE（2015）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0138196
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在大豆种子中生产酮类胡萝卜素（如角黄素和虾青素），以替代昂贵的化学合成添加剂用于动物饲料。
研究策略
利用基因枪转化法，将细菌/藻类来源的八氢番茄红素合成酶基因（crtB）和β-胡萝卜素酮化酶基因（crtW或bkt1）在种子特异性启动子控制下转入大豆，重构类胡萝卜素生物合成途径。
核心内容
该研究通过代谢工程在大豆种子中实现了酮类胡萝卜素（角黄素和虾青素）的从头合成，旨在为动物饲料提供天然替代昂贵化学合成添加剂的来源。研究者采用基因枪转化法，将细菌/藻类来源的八氢番茄红素合成酶基因（crtB）与β-胡萝卜素酮化酶基因（crtW或bkt1）置于种子特异性启动子控制下导入大豆（Glycine max cv. Jack），重构类胡萝卜素生物合成途径。结果显示，转基因种子中角黄素含量最高达52 μg/g干重（crtw-1-32事件），β-胡萝卜素含量为60–741 μg/g，虾青素含量为2–7 μg/g；pCEH1B+bkt和pCEH1B+crtW事件的角黄素平均含量分别为34±17.7 μg/g和11±6.9 μg/g。值得注意的是，大豆内源β-胡萝卜素羟化酶与外源酮化酶协同作用即可产生虾青素，无需额外引入羟化酶基因。非转基因种子仅检测到叶黄素（15 μg/g）。研究表明，按6 mg角黄素/kg饲料的需求估算，本研究T1代种子水平（约60 μg/g）理论上可满足添加要求，但T2/T3代含量较T1代下降，仍需通过喂养试验验证生物利用度并探索提高积累水平的策略。
创新点
首次在大豆种子中通过代谢工程实现酮类胡萝卜素（角黄素和虾青素）的积累；发现大豆内源β-胡萝卜素羟化酶可与外源酮化酶协同产生虾青素，无需额外引入羟化酶基因。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 大豆（Glycine max cv. Jack） | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtB | 八氢番茄红素合成酶（Phytoene synthase） | 催化 | 来自Pantoea ananatis，催化GGPP缩合形成八氢番茄红素（类胡萝卜素途径第一个关键步骤），由大豆lectin种子特异性启动子驱动 |
| 大豆（Glycine max cv. Jack） | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtW | β-胡萝卜素酮化酶（Beta-carotene ketolase） | 催化 | 来自Brevundimonas sp. strain SD212，序列经大豆密码子优化（GenBank KC954630），催化β-胡萝卜素酮化生成角黄素 |
| 大豆（Glycine max cv. Jack） | 类胡萝卜素生物合成途径 | bkt1 | β-胡萝卜素酮化酶（Beta-carotene ketolase） | 催化 | 来自Haematococcus pluvialis（原crtO），与crtW功能类似，也催化β-胡萝卜素酮化 |
| 大豆（Glycine max cv. Jack） | 类胡萝卜素生物合成途径 | Glyma10g37560 | β-胡萝卜素羟化酶（Beta-carotene hydroxylase） | 催化 | 大豆内源基因，RT-PCR证实其在种子中表达；与外源酮化酶协同作用将角黄素转化为虾青素，无需外源羟化酶 |
| 大豆（Glycine max cv. Jack） | 类胡萝卜素生物合成途径 | rbcS transit peptide | 豌豆核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亚基转运肽 | 区室化 | 用于将八氢番茄红素合成酶和酮化酶靶向质体 |
关键发现
- 转基因大豆种子中角黄素含量最高达52 μg/g干重（crtw-1-32事件），β-胡萝卜素含量达60–741 μg/g，虾青素含量为2–7 μg/g
- 还检测到八氢番茄红素、α-胡萝卜素、叶黄素、番茄红素和β-隐黄素。非转基因种子仅检测到叶黄素（15 μg/g）。pCEH1B+bkt和pCEH1B+crtW事件的角黄素平均含量分别为34±17.7 μg/g和11±6.9 μg/g。T2/T3代角黄素含量较T1代下降。Craft Technologies分析确认存在虾青素。根据估算，若要提供6 mg角黄素/kg饲料，每克大豆种子需约60 μg角黄素，本研究T1种子水平理论上可满足。
研究结论
研究表明，通过代谢工程在大豆种子中生产酮类胡萝卜素是可行的，产生的种子可作为动物饲料中角黄素和虾青素的潜在来源，有望减少或消除饲料中昂贵合成添加剂的使用。但需要进一步进行喂养试验以验证生物利用度，并可能需要引入其他策略提高积累水平。