Carbonyl reductase SCRII from Candida parapsilosis catalyzes anti-Prelog reaction to (S)-1-phenyl-1,2-ethanediol with absolute stereochemical selectivity
- 作者
- Rongzhen Zhang, Yawei Geng, Yan Xu, Wenchi Zhang, Shanshan Wang, Rong Xiao
- 单位
- 江南大学食品科学国家重点实验室; 江南大学工业生物技术教育部重点实验室暨生物工程学院; 中国科学院生物物理研究所生物大分子国家重点实验室; 罗格斯大学高等生物技术与医学中心
- 杂志
- Bioresource Technology（2010）
- DOI
- 10.1016/j.biortech.2010.08.060
- 所属领域
- 酶工程/生物催化
- 关键词
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解决的核心问题
发现并表征来自近平滑念珠菌的新型(S)-特异性羰基还原酶SCRII，其催化2-羟基苯乙酮不对称还原为(S)-1-苯基-1,2-乙二醇具有绝对立体选择性，并阐明关键残基A220和E228在底物结合和催化中的作用。
研究策略
从Candida parapsilosis中纯化SCRII，通过肽质量指纹图谱鉴定其属于短链脱氢酶/还原酶（SDR）家族；克隆其基因并在大肠杆菌中过表达；基于序列-结构比对设计定点突变（N142、A220、E228），结合酶学表征和动力学参数分析突变对活性、对映选择性和催化效率的影响。
研究路线图
核心内容
从近平滑念珠菌中分离纯化出一种新型羰基还原酶SCRII，经鉴定属于短链脱氢酶/还原酶家族。该酶催化2-羟基苯乙酮不对称还原，以绝对立体选择性生成(S)-1-苯基-1,2-乙二醇，产物光学纯度达100%，收率98.1%，显著优于已报道的同类酶。通过基因克隆在大肠杆菌中实现异源表达，重组酶比活力为6.12 U/mg，与天然酶（5.98 U/mg）相当。基于序列与结构比对构建定点突变体，发现A220和E228是底物结合与催化的关键残基，突变后比活力下降约20倍，催化效率降至野生型的7%以下，且几乎丧失对映选择性；而N142突变对酶活性影响不大。酶学性质研究表明最适温度35°C、最适pH 6.0，在pH 5.0–7.0范围内稳定性良好。这些结果不仅提供了一种适合工业应用的高立体选择性抗Prelog型羰基还原酶，也为理解SDR家族的结构-功能关系提供了关键证据。
创新点
首次报道具有绝对立体选择性的抗Prelog型羰基还原酶SCRII，产物(S)-PED对映体纯度达100%，收率高达98.1%，显著优于已报道的SCR（96.2%纯度，83.8%收率）；通过定点突变鉴定A220和E228为底物结合和催化关键残基，其突变导致酶几乎丧失对映选择性。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Candida parapsilosis CCTCC M203011 | 2-羟基苯乙酮还原为(S)-1-苯基-1,2-乙二醇 | scrII | SCRII | 催化 | 天然来源的(S)-特异性羰基还原酶，抗Prelog规则，属于短链脱氢酶/还原酶（SDR）家族 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 2-羟基苯乙酮还原为(S)-1-苯基-1,2-乙二醇 | scrII（含突变体） | 重组SCRII及突变体（N142S/N142G/A220D/A220R/A220G/E228S/E228R/E228A） | 催化 | 重组表达宿主，用于酶学表征和定点突变分析 |
关键发现
- 纯化SCRII比活力为5.98 U/mg（重组酶为6.12 U/mg），催化2-羟基苯乙酮还原为(S)-PED，光学纯度100%，收率98.1%（纯酶+NADPH），重组菌转化收率96.5%；相比之下SCR比活力2.58 U/mg，光学纯度96.1%，收率83.6%。A220和E228突变体比活力下降约20倍（0.25-0.37 U/mg），产量低于5%（如A220R为1.3%，E228A为0.8%）；NADPH反应中A220/E228突变体Km值约增加2倍（如A220G Km=9.87 μM vs WT
- 52 μM），kcat降低7.8-12.3倍（如A220G kcat=1.20 s^-1 vs WT
- 54 s^-1），催化效率(kcat/Km)小于野生型的7%（如A220G为0.12×10^6 s^-1 M^-1 vs WT
- 44×10^6 s^-1 M^-1）。N142突变（N142S/N142G）对活性和动力学参数影响不大。酶的最适温度为35°C，最适pH为6.0，40°C保温1h保留>70%活性，pH
- 0-7.0稳定。
研究结论
SCRII是一种性能优良的抗Prelog型(S)-特异性羰基还原酶，具有绝对立体选择性和高收率，适合工业应用；A220和E228残基对底物结合和催化至关重要，其突变导致对映选择性丧失和催化效率大幅下降，为SDR家族结构-功能关系研究提供了重要依据。