Biosynthesis of 3-hydroxypropionic acid from glycerol in recombinant Escherichia coli expressing Lactobacillus brevis dhaB and dhaR gene clusters and E. coli K-12 aldH
- 作者
- Suryang Kwak, Yong-Cheol Park, Jin-Ho Seo
- 单位
- Interdisciplinary Program for Bioengineering, Seoul National University; Department of Agricultural Biotechnology and Center for Food and Bio Convergence, Seoul National University; Department of Advanced Fermentation Fusion Science and Technology, Kookmin University
- 杂志
- Bioresource Technology（2012）
- DOI
- 10.1016/j.biortech.2012.11.063
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
从甘油高效生物合成3-羟基丙酸（3-HP），解决甘油脱水酶在底物甘油存在下不可逆失活的问题，需要表达再活化因子并优化发酵策略。
研究策略
从乳酸菌Lactobacillus brevis KCTC 33069克隆dhaB（甘油脱水酶）和dhaR（再活化因子）基因簇，与E. coli K-12的aldH基因共表达于E. coli BL21 star(DE3)，并设计两阶段补料分批发酵（先以葡萄糖促生长，后以甘油/葡萄糖混合液生产3-HP）。
核心内容
本研究从乳酸菌Lactobacillus brevis KCTC 33069中克隆了甘油脱水酶基因簇dhaB（含dhaB1、dhaB2、dhaB3）及其再活化因子基因簇dhaR，并与大肠杆菌K-12来源的aldH基因在E. coli BL21 star(DE3)中共表达，构建了以甘油为底物合成3-羟基丙酸（3-HP）的途径。实验证实DhaR是DhaB的再活化因子，共表达后甘油脱水酶比活由252 U/mg提高至357 U/mg，批式发酵中3-HPA产量从不足0.01 g/L提升至0.30 g/L，提高约29倍。进一步的发酵工艺优化采用两阶段补料分批策略，先以葡萄糖促进菌体生长，再以甘油/葡萄糖混合液诱导产物合成，最终在1 L工作体积中获得14.3 g/L 3-HP，生产率为0.26 g/L·h，产率达0.14 g 3-HP/g甘油，副产物乙酸和1,3-丙二醇分别仅为4.18 g/L和3.88 g/L，与批式发酵相比3-HP浓度提高14.6倍。该工作首次在重组大肠杆菌中验证了L. brevis来源的dhaB/dhaR基因簇功能，并通过再活化因子表达与发酵策略优化有效缓解了甘油脱水酶失活问题，为甘油向3-HP的高效生物转化提供了可行方案。
创新点
首次从L. brevis克隆并表征dhaB和dhaR基因簇；实验证明DhaR是DhaB的再活化因子，显著提高甘油脱水酶活性和3-HPA产量；采用两阶段补料策略实现高浓度3-HP生产且副产物较少。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21 star (DE3) | 3-羟基丙酸生物合成途径（甘油→3-HPA→3-HP） | dhaB1, dhaB2, dhaB3 | DhaB（甘油脱水酶） | 催化 | 将甘油脱水生成3-羟基丙醛（3-HPA） |
| Escherichia coli BL21 star (DE3) | 3-羟基丙酸生物合成途径（甘油→3-HPA→3-HP） | dhaR1, dhaR2 | DhaR（甘油脱水酶再活化因子） | 调控 | 通过再活化甘油失活的DhaB，提高酶活性 |
| Escherichia coli BL21 star (DE3) | 3-羟基丙酸生物合成途径（甘油→3-HPA→3-HP） | aldH | AldH（乙醛脱氢酶） | 催化 | 将3-HPA氧化为3-HP，依赖NAD+ |
关键发现
从L. brevis KCTC 33069克隆的dhaB簇包含dhaB1(1677 bp, 558 aa)、dhaB2(720 bp, 239 aa)、dhaB3(528 bp, 175 aa)，dhaR簇由dhaR1和dhaR2组成(2205 bp)。在25°C和0.2 mM IPTG下实现可溶表达。DhaB最适pH为7.0，最适辅酶B12浓度为20 μM。在20°C培养时，共表达DhaR使甘油脱水酶比活从252 U/mg提高到357 U/mg，提高1.4倍。批式发酵中，表达DhaR使3-HPA产量从<0.01 g/L提高到0.30 g/L（29倍）。两阶段补料分批发酵（1 L工作体积）获得94.2 g/L干细胞，14.3 g/L 3-HP，生产率0.26 g/L·h，产率0.14 g 3-HP/g甘油（0.15 mol/mol），副产物乙酸4.18 g/L，1,3-PDO 3.88 g/L。与批式发酵相比，3-HP浓度提高14.6倍，生产率提高8.53倍。
研究结论
通过克隆并共表达L. brevis dhaB/dhaR基因簇和E. coli aldH，以及采用两阶段补料分批发酵，重组E. coli JHS00947能够高效地将甘油转化为3-HP，产量达14.3 g/L，且副产物较少。该策略为3-HP的生物合成提供了有效方案。