Molecular Cloning and Characterisation of Farnesyl Pyrophosphate Synthase from Tripterygium wilfordii
- 作者
- Yu-Jun Zhao, Xin Chen, Meng Zhang, Ping Su, Yu-Jia Liu, Yu-Ru Tong, Xiu-Juan Wang, Lu-Qi Huang, Wei Gao
- 单位
- Capital Medical University School of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University, Beijing, People's Republic of China; National Resource Center for Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing, People's Republic of China
- 杂志
- PLoS ONE（2015）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0125415
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
雷公藤中萜类活性成分生物合成关键酶FPS的基因缺乏研究，导致其合成途径解析和微生物合成受限，亟需克隆并功能表征FPS基因。
研究策略
通过RACE技术从雷公藤中克隆两个FPS全长cDNA，利用E. coli异源表达和Ni-NTA纯化获得重组蛋白，以GC-MS检测体外酶活；用qRT-PCR分析组织表达及MeJA诱导表达模式。
核心内容
通过RACE技术从雷公藤中克隆了两个法尼基焦磷酸合酶基因TwFPS1与TwFPS2，二者开放阅读框均为1029 bp，编码342个氨基酸。将基因在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达并纯化得到约58 kDa的融合蛋白，体外酶活检测显示产物保留时间与法呢醇标准品一致（29.588 min），证实两个基因均能催化合成法尼基焦磷酸。组织表达分析表明两个基因在根中高表达，TwFPS1在根中的表达量为叶的9.5倍，TwFPS2则为21.4倍；经茉莉酸甲酯处理12小时后，两种基因表达量分别升至对照的2.4倍和4倍。这是首次对雷公藤FPS基因进行克隆与功能表征，结果提示TwFPS1和TwFPS2主要在根中发挥萜类前体供给功能且受茉莉酸信号调控，为解析雷公藤萜类活性成分生物合成途径及后续利用合成生物学手段实现相关成分的微生物生产奠定了基因基础。
创新点
首次从雷公藤中克隆并表征两个FPS基因；证实二者能在体外催化合成FPP；发现根中高表达且受MeJA诱导上调，揭示FPS在雷公藤萜类生物合成中的潜在调控作用。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Tripterygium wilfordii (雷公藤) 细胞悬浮系 | 萜类/异戊二烯生物合成途径（FPP合成） | TwFPS1 | FPS1 (法尼基焦磷酸合酶) | 催化 | 克隆自雷公藤，根中高表达（叶的9.5倍），MeJA诱导12h达峰值2.4倍 |
| Tripterygium wilfordii (雷公藤) 细胞悬浮系 | 萜类/异戊二烯生物合成途径（FPP合成） | TwFPS2 | FPS2 (法尼基焦磷酸合酶) | 催化 | 克隆自雷公藤，根中高表达（叶的21.4倍），MeJA诱导12h达峰值4倍 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 异源表达体系（FPP合成） | TwFPS1, TwFPS2 | 重组Trx-His-FPS融合蛋白 | 催化 | 用于体外酶活验证，GC-MS确认产物为法呢醇 |
关键发现
- TwFPS1 cDNA全长1345 bp，ORF 1029 bp，编码342 aa，预测分子量39.54 kDa，pI
- 59；TwFPS2 cDNA全长1312 bp，ORF 1029 bp，编码342 aa，分子量39.54 kDa，pI
- 28；重组融合蛋白约58 kDa；GC-MS表明体外酶活产物保留时间与法呢醇标准品一致（29.588 min）；TwFPS1在根中表达量为叶的9.5倍，TwFPS2为21.4倍；MeJA处理12 h后TwFPS1表达为对照2.4倍，TwFPS2为4倍。
研究结论
研究表明TwFPS1和TwFPS2是雷公藤中两个功能性的法尼基焦磷酸合酶，主要在根中表达并受MeJA诱导，可能在雷公藤萜类生物合成中发挥重要的调控作用，为利用合成生物学手段生产雷公藤萜类活性成分奠定了基础。