Accumulation of Squalene in a Microalga Chlamydomonas reinhardtii by Genetic Modification of Squalene Synthase and Squalene Epoxidase Genes
- 作者
- Masataka Kajikawa, Seiko Kinohira, Akira Ando, Miki Shimoyama, Misako Kato, Hideya Fukuzawa
- 单位
- Graduate School of Biostudies, Kyoto University; Graduate School of Humanities and Science, Ochanomizu University
- 杂志
- PLoS ONE（2015）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0120446
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
微藻中角鲨烯合成与积累的分子机制未知，缺乏有效遗传改造策略，需要在模式绿藻莱茵衣藻中鉴定并功能表征角鲨烯合酶（SQS）和角鲨烯环氧酶（SQE）基因，通过遗传改造提高角鲨烯产量。
研究策略
从莱茵衣藻基因组中鉴定出CrSQS和CrSQE基因，分别在大肠杆菌和酵母erg1突变体中验证其酶活；通过瞬时表达分析亚细胞定位；在莱茵衣藻中过表达CrSQS、利用人工microRNA敲低CrSQE，以及共转化CrSQS过表达和CrSQE敲低，检测菌株角鲨烯和甾醇含量及生长状况。
核心内容
从莱茵衣藻基因组鉴定出角鲨烯合酶（CrSQS）与角鲨烯环氧酶（CrSQE）基因，分别在大肠杆菌和酵母erg1突变体中验证了其酶学功能，并通过瞬时表达证明二者均定位于内质网。在此基础上对莱茵衣藻进行遗传改造：过表达CrSQS使转录水平提升3至4倍，14C-FPP向角鲨烯的转化速率提高1.6至1.7倍，但未检测到角鲨烯积累；利用人工microRNA部分敲低CrSQE（表达量降低59%至76%）则使角鲨烯积累至0.9至1.1微克每毫克干重（约2.3至2.7纳摩尔每毫克），且未见生长抑制，同时MEP途径基因CrCMK表达上调2.2至4.9倍。将CrSQS过表达与CrSQE敲低共转化并未显著提升角鲨烯含量。结果表明，部分抑制角鲨烯环氧酶是驱动莱茵衣藻积累角鲨烯的有效策略，而单独增强合酶活性受下游代谢瓶颈限制，未来可结合MEP途径强化以进一步提高产量。
创新点
['首次在莱茵衣藻中功能表征角鲨烯合酶和角鲨烯环氧酶', '利用人工microRNA部分敲低CrSQE实现角鲨烯积累而不抑制生长', '通过共定位实验证明CrSQS和CrSQE均定位于内质网']
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Chlamydomonas reinhardtii | 角鲨烯/甾醇生物合成途径 | CrSQS | 角鲨烯合酶 | 催化 | 过表达增强FPP转化为角鲨烯，但未引起角鲨烯积累 |
| Chlamydomonas reinhardtii | 角鲨烯/甾醇生物合成途径 | CrSQE | 角鲨烯环氧酶 | 催化 | 部分敲低使角鲨烯积累至0.9-1.1 μg/mg干重 |
| Chlamydomonas reinhardtii | MEP途径 | CrCMK | 4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶 | 催化 | CrSQE敲低后表达上调2.2-4.9倍 |
| Saccharomyces cerevisiae | 角鲨烯/甾醇生物合成途径 | CrSQE | 角鲨烯环氧酶 | 催化 | 异源表达互补erg1突变体KLN1的生长缺陷 |
| Escherichia coli | 角鲨烯/甾醇生物合成途径 | CrSQS | 角鲨烯合酶 | 催化 | 重组表达验证酶活性 |
关键发现
['CrSQS在大肠杆菌中重组表达具有角鲨烯合酶活性，催化14C-FPP转化为角鲨烯，需NADPH和Mg2+/Mn2+', 'CrSQE在酵母erg1突变体中表达可恢复ergosterol合成，证明具有角鲨烯环氧酶功能', 'CrSQS过表达株系中CrSQS表达量提高3-4倍，14C-FPP向角鲨烯转化速率提高1.6-1.7倍，但角鲨烯未检测到积累', '50 mg/L特比萘芬处理使角鲨烯积累达18.7 nmol/mg干重，100 mg/L时下游甾醇总量减少72%，150 mg/L时细胞白化', 'CrSQE敲低株系中CrSQE表达量降低59-76%，角鲨烯积累至0.9-1.1 μg/mg细胞干重（2.3-2.7 nmol/mg），无生长抑制', 'CrSQE敲低株系中MEP途径基因CrCMK表达上调2.2-4.9倍', 'CrSQS过表达与CrSQE敲低共转化株系中角鲨烯含量未显著高于单独CrSQE敲低株系']
研究结论
部分敲低CrSQE是提高莱茵衣藻角鲨烯产量的有效策略，而单独过表达CrSQS不足以增加角鲨烯积累，未来可结合MEP途径增强以进一步提高产量。