Enhanced pathway efficiency of Saccharomyces cerevisiae by introducing thermo-tolerant devices
- 作者
- Yueqin Liu, Genli Zhang, Huan Sun, Xiangying Sun, Nisi Jiang, Aamir Rasool, Zhanglin Lin, Chun Li
- 单位
- School of Chemical Engineering, Tianjin University; School of Life Science, Beijing Institute of Technology; Tsinghua University
- 杂志
- Bioresource Technology（2014）
- DOI
- 10.1016/j.biortech.2014.07.063
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
酿酒酵母最适生长温度低（28-30°C），高于此温度时细胞活力和发酵能力下降，导致酶催化效率低、能耗高，难以满足工业高温发酵需求。
研究策略
从嗜热菌Thermoanaerobacter tengcongensis中克隆热休克蛋白基因，构建由强组成型启动子FBA1p驱动的耐热设备表达盒，导入酿酒酵母，以增强其耐热性，并将耐热设备应用于β-香树脂醇合成菌株，验证其对途径效率的促进作用。
核心内容
针对酿酒酵母最适生长温度偏低、难以满足工业高温发酵需求的问题，该研究从嗜热菌腾冲嗜热厌氧杆菌中克隆了十种热休克蛋白基因，并在强组成型启动子FBA1p驱动下构建耐热设备表达盒，导入酿酒酵母进行系统评估。结果显示，表达T.te-TTE2469、T.te-GroS2和T.te-IbpA的工程菌细胞密度提高超过25%，细胞活力为对照的1.5至4倍；其中T.te-GroS2在两种培养条件下72小时细胞活力分别达到对照的3.2倍和4倍。进一步机制分析表明，耐热设备不仅直接保护蛋白质构象，还通过上调cdc19和tps1等应激相关基因，增强能量代谢并提高海藻糖积累至21.7 mg/L。将耐热设备导入β-香树脂醇生产菌株后，最适生长温度拓宽至28至35°C，35°C下产物滴度相比30°C对照提高28.1%，发酵周期从120小时缩短至48小时，38°C下合成效率仍高于30°C对照21.2%。该策略通过引入嗜热菌热休克蛋白有效提升酵母耐热性和途径效率，为工业高温发酵提供了可行方案。
创新点
['首次从嗜热菌T. tengcongensis克隆多种热休克蛋白基因并构建耐热设备，系统评估其赋予酿酒酵母的耐热性。', '发现耐热设备不仅保护蛋白质构象，还通过上调cdc19和tps1等应激相关基因，协同提高细胞代谢能量和海藻糖含量。', '将耐热设备导入β-香树脂醇生产菌株，使最适生长温度范围拓宽至28-35°C，β-香树脂醇滴度提高28.1%，发酵周期缩短72小时。']
研究对象（13）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | 热应激响应 | tte2469 | 泛素（ubiquitin） | 调控 | 来自Thermoanaerobacter tengcongensis，编码泛素蛋白，参与蛋白质稳定性调控，表达水平最高 |
| Saccharomyces cerevisiae | 热应激响应 | thif | ThiF（泛素相关蛋白） | 调控 | 来自T. tengcongensis，编码泛素蛋白，与tte2469类似 |
| Saccharomyces cerevisiae | 热应激响应 | gros2 | GroS2（HSP10） | 调控 | 来自T. tengcongensis，小热休克蛋白，效果最优之一 |
| Saccharomyces cerevisiae | 热应激响应 | ibpa | IbpA（HSP20） | 调控 | 来自T. tengcongensis，小热休克蛋白 |
| Saccharomyces cerevisiae | 热应激响应 | hsl0 | HslO（HSP33） | 调控 | 来自T. tengcongensis，热休克蛋白33家族 |
| Saccharomyces cerevisiae | 热应激响应 | dnaJ | DnaJ（HSP40） | 调控 | 来自T. tengcongensis，分子伴侣 |
| Saccharomyces cerevisiae | 热应激响应 | groEL | GroEL（HSP60） | 调控 | 来自T. tengcongensis，分子伴侣，表达水平高 |
| Saccharomyces cerevisiae | 热应激响应 | groES | GroES（HSP60共伴侣） | 调控 | 来自T. tengcongensis，分子伴侣 |
| Saccharomyces cerevisiae | 热应激响应 | grpE | GrpE（HSP70共伴侣） | 调控 | 来自T. tengcongensis，核苷酸交换因子 |
| Saccharomyces cerevisiae | 热应激响应 | dnak | DnaK（HSP70） | 调控 | 来自T. tengcongensis，分子伴侣 |
| Saccharomyces cerevisiae | 糖酵解 | cdc19 | 丙酮酸激酶（pyruvate kinase） | 能量供给 | 内源基因，参与ATP生成，在耐热菌株中表达显著上调 |
| Saccharomyces cerevisiae | 海藻糖合成 | tps1 | 海藻糖-6-磷酸合酶 | 催化 | 内源基因，表达上调，促进海藻糖积累 |
| Saccharomyces cerevisiae | β-香树脂醇合成 | — | β-香树脂醇合酶（未具体提及） | 催化 | 利用已有β-香树脂醇生产菌株Sg-sb，未列出具体基因 |
关键发现
- 在10株工程菌中，T.te-TTE2469、T.te-GroS2和T.te-IbpA的细胞密度提高超过25%，细胞活力为对照的1.5-4倍
- T.te-GroS2在72小时细胞活力分别是对照的3.2倍和4倍（两种培养条件下）
- Congo Red实验中T.te-GroS2细胞活力为(83.5±4.2)%，对照为(50±6.5)%，高1.5倍
- 海藻糖积累量T.te-TTE2469、T.te-GroS2和T.te-IbpA分别为(14.5±1.5)、(21.7±2.1)、(10.7±1.3) mg/L，均高于对照
- tps1和cdc19基因表达显著上调。在β-香树脂醇合成菌株中，Sg-sb-T.te-GroS2在35°C下β-香树脂醇滴度比30°C对照提高(28.1±2.6)%，比35°C对照提高(49.2±1.4)%
- 在38°C下，β-香树脂醇滴度仅比30°C对照降低(2.9±0.2)%，而细胞密度却降低(18.3±1.3)%
- 发酵周期从120小时缩短至48小时（缩短72小时），β-香树脂醇合成效率在38°C下提高(21.2±1.5)%（对比30°C对照）和(46.7±3.3)%（对比38°C对照）。
研究结论
通过导入来自嗜热菌T. tengcongensis的热休克蛋白基因构建耐热设备，有效提高了酿酒酵母的耐热性，将最适生长温度范围拓宽至28-35°C；耐热设备具有双重保护作用，既直接保护蛋白质，又通过上调cdc19和tps1等基因增强能量代谢和海藻糖积累，从而增强整体代谢活性；在β-香树脂醇合成菌株中，耐热设备使β-香树脂醇滴度提高28.1%，发酵周期缩短72小时，显著提升了途径效率和工业可行性。