Reducing cofactors contribute to the increase of butanol production by a wild-type Clostridium sp. strain BOH3
- 作者
- Tinggang Li, Yu Yan, Jianzhong He
- 单位
- Department of Civil and Environmental Engineering, National University of Singapore, Singapore 117576, Singapore
- 杂志
- Bioresource Technology（2014）
- DOI
- 10.1016/j.biortech.2013.12.089
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
野生型Clostridium sp. BOH3的丁醇合成受限于还原型辅因子（NADH/NADPH）供应不足，传统基因改造菌株存在不稳定问题，需通过辅因子操纵提高丁醇生产效率。
研究策略
在培养基中添加烟酸（NA）作为NADH/NADPH前体以提高胞内还原力，并采用两阶段pH-shift策略（先pH 6.0维持6小时，再降至pH 5.0维持）优化细胞生长与丁醇合成，从而重定向碳代谢流至丁醇。
核心内容
针对野生型丁醇生产菌株Clostridium sp. BOH3还原力供应不足的问题，该研究提出在培养基中添加烟酸作为NADH/NADPH前体，并配合两阶段pH-shift策略（先pH 6.0维持6小时再降至pH 5.0），在不进行基因改造的前提下强化丁醇合成。添加10 mg/L烟酸使胞内NADH和NADPH总水平分别提高1.95倍和2.27倍，NADH/NAD+比值由0.78升至2.31，两种辅因子依赖的丁醇脱氢酶活性也显著提升。在两阶段pH-shift条件下，菌株产丁醇18.7 g/L，产率24.6%，生产力0.26 g/L·h；与无烟酸对照相比丁醇产量提高16%，与无pH-shift对照相比提高179%，丁醇与丙酮及生物酸的比例也明显改善。结果表明通过化学手段增强还原性辅因子供给并优化发酵条件，可有效提升野生型梭菌的丁醇生产效率，达到与基因工程菌株相当的水平，为工业丁醇发酵提供了一种无需基因操作的可行替代方案。
创新点
['首次通过添加烟酸提高野生型梭菌胞内NADH/NADPH水平来增强丁醇合成，无需基因改造。', '建立两阶段pH-shift策略，同时最大化细胞生长速率和丁醇生成速率。', '实现高浓度丁醇（18.7 g/L）生产，产量和生产力优于多数野生型菌株，可与基因工程菌株媲美。']
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Clostridium sp. strain BOH3 | 丁醇合成途径（ABE发酵） | — | BADH（丁醛脱氢酶） | 催化 | NADH依赖型，催化丁酰-CoA还原为丁醛，NADPH依赖型活性未检出。 |
| Clostridium sp. strain BOH3 | 丁醇合成途径（ABE发酵） | — | BDH（丁醇脱氢酶） | 催化 | 同时具有NADH和NADPH依赖活性，催化丁醛还原为丁醇。 |
| Clostridium sp. strain BOH3 | 丁醇合成途径（ABE发酵） | — | AAD（醇/醛脱氢酶） | 催化 | 双功能酶，参与丁醇和乙醇合成，对丁醛亲和力更高。 |
| Clostridium sp. strain BOH3 | 还原性辅因子代谢 | — | NADH/NADPH（还原型辅因子） | 能量供给 | 通过补充烟酸前体增强细胞内NADH/NADPH水平，为丁醇合成提供还原力。 |
关键发现
- 添加10 mg/L烟酸后，胞内NADH和NADPH总水平分别提高1.95倍和2.27倍，NADH/NAD+比值由0.78升至2.31，NADPH/NADP+比值由0.36升至1.23。在两阶段pH-shift条件下，野生型BOH3产丁醇18.7 g/L，产率24.6%（摘要为24.0%），生产力0.26 g/L·h，ABE总溶剂27.8 g/L
- 与无NA对照相比，丁醇产量提高16%，细胞生长提高11%，丁醇/丙酮比达11%，丁醇/生物酸比292%，生物溶剂/生物酸比提高约2.2倍。NADH依赖型BDH活性提高约2倍，NADPH依赖型BDH活性提高约1.6倍，NADH依赖型BADH活性提高约64%。与无pH-shift对照相比，丁醇产量提高179%。
研究结论
通过添加烟酸增强NADH/NADPH供给并配合两阶段pH-shift策略，可显著提高野生型Clostridium sp. BOH3的丁醇合成能力，实现18.7 g/L丁醇、24.6%产率和0.26 g/L·h生产力，证明还原性辅因子操纵是替代基因工程的有效代谢工程策略。