Enhanced cellulase producing mutants developed from heterokaryotic Aspergillus strain
- 作者
- Baljit Kaur, H.S. Oberoi, B.S. Chadha
- 单位
- Department of Microbiology, Guru Nanak Dev University, Amritsar 143 005, India; Central Institute of Post Harvest Engineering Technology (CIPHET), Ludhiana 141 004, India
- 杂志
- Bioresource Technology（2014）
- DOI
- 10.1016/j.biortech.2014.01.016
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
解决野生型曲霉纤维素酶产量低、易受产物抑制的问题，获得纤维素酶超产突变株。
研究策略
以曲霉属种间原生质体融合获得的异核体28为出发菌株，采用UV和MNNG联合循环诱变，逐步提高2-脱氧葡萄糖(2-DG)浓度筛选去调控突变株；通过基因组（β-葡萄糖苷酶基因测序）和蛋白质组（SDS-PAGE、酶谱、肽质量指纹图谱）表征；并将突变株纤维素酶用于碱处理稻草的水解与发酵。
核心内容
本研究以曲霉属种间原生质体融合获得的异核体28为出发菌株，采用UV和MNNG联合循环诱变，并通过逐步提高2-脱氧葡萄糖浓度筛选去调控突变株，旨在解决野生型曲霉纤维素酶产量低、易受产物抑制的问题。经多轮筛选获得突变株64和突变株A，并通过β-葡萄糖苷酶基因测序、SDS-PAGE、酶谱及肽质量指纹图谱进行基因组和蛋白质组表征。结果表明，突变株64在摇瓶发酵中内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、纤维二糖水解酶、FPase和木聚糖酶分别较异核体28提高9.83、7.8、3.2、4.2和19.74倍，最高酶活分别达12.10、159.48、3.52、0.787和478.45 U/ml；固态发酵中突变株A产酶更高。β-葡萄糖苷酶动力学显示Km从0.22 mM降至0.09 mM，Vmax从14.36升至49.66 μmol min⁻¹ mg⁻¹蛋白，表明酶对底物亲和力和催化效率均显著改善。突变株A糖化碱处理稻草（15%底物）达70.2%，水解液含葡萄糖29.3 mg/ml、木糖36.2 mg/ml，发酵得乙醇15 g/l；两步法中木聚糖酶处理释放木寡糖22 g/l，残渣用商品纤维素酶糖化发酵产乙醇31.2 g/l。该研究建立的循环诱变结合梯度筛选体系可有效提升曲霉纤维素酶产量，所得突变株可用于农业废弃物高效转化，联产燃料乙醇和木寡糖等高值产品。
创新点
建立循环诱变结合2-DG梯度筛选的菌株改良体系；通过基因和蛋白组学解析突变株；开发碱处理稻草两步酶解联产木寡糖和乙醇的新工艺。
研究对象（13）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Aspergillus nidulans × Aspergillus tubingensis 异核体28及其突变株 | 纤维素降解 | bgl | β-葡萄糖苷酶 | 催化 | 循环诱变后基因发生缺失/替换，酶动力学Km从0.22 mM降至0.09 mM，Vmax从14.36升至49.66 μmol min⁻¹ mg⁻¹蛋白 |
| Aspergillus nidulans × Aspergillus tubingensis 突变株64 | 纤维素降解 | — | 内切葡聚糖酶 | 催化 | 摇瓶产量12.10 U/ml，较出发菌株提高9.83倍 |
| Aspergillus nidulans × Aspergillus tubingensis 突变株64 | 纤维素降解 | — | 纤维二糖水解酶 | 催化 | 摇瓶产量3.52 U/ml，较出发菌株提高3.2倍 |
| Aspergillus nidulans × Aspergillus tubingensis 突变株64 | 纤维素降解 | — | 总纤维素酶(FPase) | 催化 | 摇瓶产量0.787 U/ml，较出发菌株提高4.2倍 |
| Aspergillus nidulans × Aspergillus tubingensis 突变株64 | 半纤维素降解 | — | 木聚糖酶 | 催化 | 摇瓶产量478.45 U/ml，较出发菌株提高19.74倍 |
| Aspergillus nidulans × Aspergillus tubingensis 突变株A | 纤维素降解 | — | 内切葡聚糖酶 | 催化 | 固态发酵产量243.2 U/gds，较出发菌株提高1.93倍 |
| Aspergillus nidulans × Aspergillus tubingensis 突变株A | 纤维素降解 | — | β-葡萄糖苷酶 | 催化 | 固态发酵产量1114.3 U/gds |
| Aspergillus nidulans × Aspergillus tubingensis 突变株A | 纤维素降解 | — | 纤维二糖水解酶 | 催化 | 固态发酵产量65.0 U/gds |
| Aspergillus nidulans × Aspergillus tubingensis 突变株A | 纤维素降解 | — | 总纤维素酶(FPase) | 催化 | 固态发酵产量10.9 U/gds |
| Aspergillus nidulans × Aspergillus tubingensis 突变株A | 半纤维素降解 | — | 木聚糖酶 | 催化 | 固态发酵产量3476.9 U/gds |
| Thermomyces lanuginosus | 半纤维素降解 | — | 木聚糖酶（无纤维素酶活性） | 催化 | 摇瓶产量2800 U/ml，用于两步法水解半纤维素释放木寡糖 |
| Aspergillus niger (通过PMF鉴定的同源蛋白) | 纤维素/半纤维素降解 | — | α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶 (GH43) | 催化 | 在突变株O中过表达，经肽质量指纹图谱鉴定 |
| Aspergillus niger (通过PMF鉴定的同源蛋白) | 半纤维素降解 | — | 内切-1,4-β-木聚糖酶 (GH10) | 催化 | 在突变株O中过表达，经肽质量指纹图谱鉴定 |
关键发现
突变株64较融合子28在摇瓶发酵中内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、纤维二糖水解酶、FPase和木聚糖酶分别提高9.83、7.8、3.2、4.2和19.74倍，酶活分别达12.10、159.48、3.52、0.787和478.45 U/ml。固态发酵中突变株A产酶分别达243.2、1114.3、65.0、10.9和3476.9 U/gds。β-葡萄糖苷酶动力学Km从0.22 mM降至0.09 mM，Vmax从14.36升至49.66 μmol min⁻¹ mg⁻¹蛋白。突变株A糖化碱处理稻草（15%底物）达70.2%，水解液含葡萄糖29.3 mg/ml、木糖36.2 mg/ml、阿拉伯糖8.8 mg/ml，发酵得乙醇15 g/l。两步法中，Thermomyces lanuginosus木聚糖酶处理释放XOS 22 g/l（木二糖12.6 g/l等），残渣用商品纤维素酶（17.5 FPU+35 CBU）糖化发酵产乙醇31.2 g/l，用突变株A纤维素酶产乙醇12.0 g/l。
研究结论
循环诱变与合理筛选结合分子和蛋白质组学方法能有效提升曲霉纤维素酶产量，所得突变株可用于农业废弃物高效转化，联产燃料乙醇和木寡糖等高值产品。