Expression of Lactococcus lactis NADH oxidase increases 2,3-butanediol production in Pdc-deficient Saccharomyces cerevisiae
- 作者
- Jin-Woo Kim, Seung-Oh Seo, Guo-Chang Zhang, Yong-Su Jin, Jin-Ho Seo
- 单位
- 首尔国立大学农业生物技术系和食品生物融合中心，首尔151-921，韩国；伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校食品科学与人类营养系和基因组生物学研究所，厄巴纳，IL 61801，美国
- 杂志
- Bioresource Technology（2015）
- DOI
- 10.1016/j.biortech.2015.02.077
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在丙酮酸脱羧酶（Pdc）缺陷的酿酒酵母中，2,3-丁二醇生物合成途径导致胞质NADH过量积累，造成大量甘油副产物生成，需要降低甘油产量并提高2,3-丁二醇产量。
研究策略
在Pdc缺陷且携带2,3-丁二醇途径的酿酒酵母中，以不同拷贝数和启动子（CYC1、GPD2、TDH3）表达乳酸乳球菌的水形成型NADH氧化酶（noxE），调节胞内NADH/NAD+比例，将碳流从甘油重定向至2,3-丁二醇。
核心内容
在丙酮酸脱羧酶（Pdc）缺陷的酿酒酵母中，2,3-丁二醇合成途径会引起胞质NADH过量积累，导致甘油大量生成。本研究在携带2,3-丁二醇途径的Pdc缺陷菌株中，以不同启动子（CYC1、GPD2、TDH3）和质粒拷贝数组合表达乳酸乳球菌的水形成型NADH氧化酶（noxE），实现五种差异化表达水平，以调节胞内NADH/NAD+比例，将碳流从甘油重定向至目标产物。在生物反应器发酵中，表达noxE的菌株BD5_T2nox的2,3-丁二醇产率达0.359 g/g葡萄糖，较对照提高23.8%，甘油产率降至0.069 g/g葡萄糖，降低65.3%；胞内NADH/NAD+比值从0.31降至0.14。摇瓶实验中该菌株的2,3-丁二醇产率提高10.7%，甘油产率降低25.1%。此外，补充0.5 g/L乙醇可显著促进菌株生长与葡萄糖消耗。结果表明，通过水形成型NADH氧化酶调节辅因子平衡，能够有效减少甘油副产物并提升还原型产物的合成效率，为Pdc缺陷酵母中2,3-丁二醇的生产提供了一种可行策略。
创新点
利用水形成型NADH氧化酶调节辅因子平衡，无需消耗代谢中间物；通过组合不同启动子和质粒拷贝数实现noxE的五种差异表达水平；发现2,3-丁二醇途径的引入使Pdc缺陷菌株能在葡萄糖为唯一碳源的合成培养基上生长。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae SOS5（Pdc缺陷：Δpdc1 Δpdc5 Δpdc6） | 2,3-丁二醇生物合成途径 | alsS | 乙酰乳酸合酶 | 催化 | 来自Bacillus subtilis，将两分子丙酮酸缩合为α-乙酰乳酸 |
| Saccharomyces cerevisiae SOS5（Pdc缺陷：Δpdc1 Δpdc5 Δpdc6） | 2,3-丁二醇生物合成途径 | alsD | 乙酰乳酸脱羧酶 | 催化 | 来自Bacillus subtilis，将α-乙酰乳酸脱羧为乙偶姻 |
| Saccharomyces cerevisiae SOS5（Pdc缺陷：Δpdc1 Δpdc5 Δpdc6） | 2,3-丁二醇生物合成途径 | BDH1 | 2,3-丁二醇脱氢酶 | 催化 | 酿酒酵母内源基因，将乙偶姻还原为2,3-丁二醇 |
| Saccharomyces cerevisiae SOS5（Pdc缺陷：Δpdc1 Δpdc5 Δpdc6） | 辅因子再生 | noxE | 水形成型NADH氧化酶 | 催化 | 来自Lactococcus lactis subsp. cremoris MG1363，将NADH氧化为NAD+并产生水 |
| Saccharomyces cerevisiae SOS5（Pdc缺陷：Δpdc1 Δpdc5 Δpdc6） | 乙醇合成 | PDC1/PDC5/PDC6 | 丙酮酸脱羧酶 | 催化 | 通过敲除这三个基因构建Pdc缺陷菌株，阻断乙醇合成以利于2,3-丁二醇积累 |
关键发现
- 在生物反应器发酵中，表达noxE的BD5_T2nox菌株2,3-丁二醇产率达0.359 g/g葡萄糖，甘油产率为0.069 g/g葡萄糖，较无noxE对照组分别提高23.8%和降低65.3%
- 胞内NADH/NAD+比值从对照的0.31降至0.14
- NADH氧化酶活性最高达9.153 U/mg蛋白（BD5_T2nox），对照为4.8 mU/mg
- 在摇瓶含80 g/L葡萄糖和0.5 g/L乙醇条件下，BD5_T2nox的2,3-丁二醇产率较对照提高10.7%，甘油产率降低25.1%（基于表3数据）
- 早期指数期乙偶姻积累最高0.53 g/L，是对照0.06 g/L的9倍，但最终各菌株乙偶姻产率相近（0.009-0.012 g/g葡萄糖）
- 补充0.5 g/L乙醇显著提高BD5_T2nox的生长和葡萄糖消耗速率。
研究结论
通过在Pdc缺陷酿酒酵母中表达NADH氧化酶并补充少量乙醇，成功降低了甘油生成，提高了2,3-丁二醇产率，证明调节NADH/NAD+比例是改善还原型产物合成的有效策略。