Integrating an algal β-carotene hydroxylase gene into a designed carotenoid-biosynthesis pathway increases carotenoid production in yeast
- 作者
- Jui-Jen Chang, Caroline Thia, Hao-Yeh Lin, Hsien-Lin Liu, Feng-Ju Ho, Jiunn-Tzong Wu, Ming-Che Shih, Wen-Hsiung Li, Chieh-Chen Huang
- 单位
- Department of Medical Research, China Medical University Hospital; Biodiversity Research Center, Academia Sinica; Agricultural Biotechnology Research Center, Academia Sinica; Department of Life Sciences, National Chung Hsing University
- 杂志
- Bioresource Technology（2014）
- DOI
- 10.1016/j.biortech.2014.11.097
- 所属领域
- 代谢工程/合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
提高酵母中类胡萝卜素（尤其是虾青素）的产量，通过引入藻类β-胡萝卜素羟化酶基因来克服真菌来源酶效率低的瓶颈。
研究策略
采用PGASO合成生物学工具，将来自马克斯克鲁维酵母、Xanthophyllomyces dendrorhous和三种绿藻的十个类胡萝卜素合成相关基因按设计顺序整合到马克斯克鲁维酵母基因组中，构建三个含不同藻源chyb基因的工程菌株，并与含真菌crtS/crtR的对照菌株比较。
研究路线图
核心内容
该研究利用PGASO合成生物学工具，将来自马克斯克鲁维酵母、Xanthophyllomyces dendrorhous及三种绿藻的十个类胡萝卜素合成相关基因按设计顺序整合到马克斯克鲁维酵母基因组中，构建了三个分别含不同藻源β-胡萝卜素羟化酶基因（Crchyb、Czchyb、Hpchyb）的工程菌株，并与含真菌来源crtS/crtR的对照菌株进行比较。结果显示，含Hpchyb的菌株Hp9总类胡萝卜素含量达161.7 μg/g，分别比含Crchyb和Czchyb的菌株高约25%；其β-胡萝卜素含量为224.4 μg/g，转化速率是含Crchyb菌株的3.8倍；角黄素含量为39.8 μg/g，是含Czchyb菌株的3.1倍。各工程菌株总类胡萝卜素产量均远超野生型的4.4 μg/g。研究表明藻源β-胡萝卜素羟化酶（尤其是Hpchyb）在催化β-胡萝卜素下游转化方面显著优于真菌来源酶，是类胡萝卜素生物合成的关键限速酶，通过设计合成途径并筛选高效酶可有效提升酵母中类胡萝卜素产量。
创新点
设计并组装了包含藻源β-胡萝卜素酮酶和三种不同藻源β-胡萝卜素羟化酶的组合途径；首次在酵母中比较了Crchyb、Czchyb和Hpchyb的效率，证明Hpchyb效率最高；证明藻源羟化酶优于真菌来源。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 马克斯克鲁维酵母 (Kluyveromyces marxianus) | 甲羟戊酸途径 | tHMG1 | truncated 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase | 催化 | 来自Kluyveromyces marxianus KY3，截短HMG-CoA还原酶，增加异戊二烯前体供应 |
| 马克斯克鲁维酵母 (Kluyveromyces marxianus) | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtE | geranylgeranyl pyrophosphate synthase | 催化 | 来自Xanthophyllomyces dendrorhous，催化GGPP合成 |
| 马克斯克鲁维酵母 (Kluyveromyces marxianus) | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtYB | bifunctional phytoene synthase/lycopene cyclase | 催化 | 来自Xanthophyllomyces dendrorhous，双功能酶 |
| 马克斯克鲁维酵母 (Kluyveromyces marxianus) | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtI | phytoene desaturase | 催化 | 来自Xanthophyllomyces dendrorhous |
| 马克斯克鲁维酵母 (Kluyveromyces marxianus) | 类胡萝卜素生物合成途径 | Crbkt | β-carotene ketolase | 催化 | 来自Chlamydomonas reinhardtii，催化β-胡萝卜素酮化 |
| 马克斯克鲁维酵母 (Kluyveromyces marxianus) | 类胡萝卜素生物合成途径 | Crchyb | β-carotene hydroxylase | 催化 | 来自Chlamydomonas reinhardtii |
| 马克斯克鲁维酵母 (Kluyveromyces marxianus) | 类胡萝卜素生物合成途径 | Czchyb | β-carotene hydroxylase | 催化 | 来自Chlorella zofingiensis |
| 马克斯克鲁维酵母 (Kluyveromyces marxianus) | 类胡萝卜素生物合成途径 | Hpchyb | β-carotene hydroxylase | 催化 | 来自Haematococcus pluvialis，效率最高 |
| 马克斯克鲁维酵母 (Kluyveromyces marxianus) | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtS | astaxanthin synthase | 催化 | 来自Xanthophyllomyces dendrorhous，用于对照菌株Xd7-3 |
| 马克斯克鲁维酵母 (Kluyveromyces marxianus) | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtR | cytochrome P450 reductase | 催化 | 来自Xanthophyllomyces dendrorhous，用于对照菌株Xd7-3 |
关键发现
- 总类胡萝卜素含量：WT
- 4 μg/g，Xd7-3
- 5 μg/g，Cr1
- 2 μg/g，Cz5
- 7 μg/g，Hp9
- 7 μg/g；Hp9比Cr1/Cz5高约25%。β-胡萝卜素含量：Xd7-3
- 7 μg/g，Cr1
- 6 μg/g，Cz5
- 9 μg/g，Hp9
- 4 μg/g；Hp9比Cr1快3.8倍。角黄素含量：Cr1
- 4 μg/g，Cz5
- 8 μg/g，Hp9
- 8 μg/g；Hp9比Cz5快3.1倍。工程酵母比藻类培养快7倍，但H. pluvialis的总类胡萝卜素产量是工程酵母的约250倍。
研究结论
藻源β-胡萝卜素羟化酶（特别是Hpchyb）比真菌来源的crtS/crtR更高效地转化β-胡萝卜素为下游类胡萝卜素，β-胡萝卜素羟化酶是类胡萝卜素生物合成的关键酶；通过设计途径和选择高效酶可提高酵母中类胡萝卜素产量。