Progress on molecular breeding and metabolic engineering of biosynthesis pathways of \(C_{30}\) , \(C_{35}\) , \(C_{40}\) , \(C_{45}\) , \(C_{50}\) carotenoids
- 作者
- Fei Wang, Jian Guo Jiang, Qian Chen
- 单位
- College of Food and Bioengineering, South China University of Technology, Guangzhou 510640, People's Republic of China
- 杂志
- Biotechnology Advances（2006）
- DOI
- 10.1016/j.biotechadv.2006.12.001
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何通过分子育种和代谢工程方法改造类胡萝卜素生物合成途径，以产生不同碳链长度（C30、C35、C40、C45、C50）的天然和非天然类胡萝卜素。
研究策略
综述天然C30、C40、C50途径，利用上游关键酶（CrtB、CrtI、CrtY、CrtM、CrtN等）的工程改造（如定向进化、单点突变）和下游具有广泛底物特异性的修饰酶（CrtA、CrtO、CrtU、CrtZ、CrtX等）来延伸天然途径，并构建C35、C45、C50等非天然途径。
核心内容
该文系统综述了通过分子育种与代谢工程手段改造类胡萝卜素生物合成途径的策略。研究者以大肠杆菌为底盘，围绕天然存在的C30、C40类胡萝卜素途径，对上游关键合成酶（如CrtM、CrtN、CrtB、CrtI、CrtY）进行定向进化与单点突变，并利用下游具有宽底物特异性的修饰酶（如CrtA、CrtO、CrtU、CrtZ、CrtX）延伸途径，从而构建了C35、C45、C50等非天然碳骨架。关键结果包括：CrtM的F26L或F26S单氨基酸替换可将其从C30合酶转变为C40合酶，W38G与E180G突变亦有同等效果；CrtM变体还能异源缩合不同长度的异戊二烯前体，产生C35骨架apophytoene以及C45、C50骨架产物。此外，CrtN在重组大肠杆菌中可将diapophytoene脱氢4步生成diapolycopene，高于天然C30途径的3步。通过途径延伸，共获得9种新的C30/C40类胡萝卜素结构和1种推测的C35类胡萝卜素。这些结果表明，组合上游合成酶工程改造与下游混杂修饰酶，能有效扩展类胡萝卜素的结构多样性，有望将已知类胡萝卜素种类提高一倍以上。
创新点
通过单氨基酸替换（如F26L/F26S）将C30合酶CrtM改造为C40合酶，通过进一步突变产生C35、C45、C50骨架；利用突变体CrtI_m和CrtY_m延伸C40途径，首次在重组大肠杆菌中合成深紫色类胡萝卜素phillipsiaxanthin和环状C30类胡萝卜素diapotorulene等。
研究对象（15）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 大肠杆菌（E. coli） | C30类胡萝卜素途径 | crtM | CrtM（diapophytoene synthase） | 催化 | 催化两分子FPP缩合生成diapophytoene，是C30途径的关键合酶；经定点突变可获得C40、C35、C45、C50合成能力。 |
| 大肠杆菌（E. coli） | C30类胡萝卜素途径 | crtN | CrtN（diapophytoene desaturase） | 催化 | 催化diapophytoene脱氢，在重组E. coli中可引入4个双键生成diapolycopene，也可作用于C35底物。 |
| 大肠杆菌（E. coli） | C40类胡萝卜素途径 | crtB | CrtB（phytoene synthase） | 催化 | 催化两分子GGDP缩合生成phytoene，启动C40途径。 |
| 大肠杆菌（E. coli） | C40类胡萝卜素途径 | crtI | CrtI（phytoene desaturase） | 催化 | 催化phytoene连续脱氢生成ζ-胡萝卜素、neurosporene或lycopene；突变体CrtI_m可生成四脱氢番茄红素。 |
| 大肠杆菌（E. coli） | C40类胡萝卜素途径 | crtY | CrtY（lycopene cyclase） | 催化 | 催化lycopene环化生成β-胡萝卜素；突变体CrtY_m可环化didehydrolycopene生成torulene。 |
| 大肠杆菌（E. coli） | C40类胡萝卜素途径 | crtA | CrtA（monooxygenase） | 催化 | 单加氧酶，引入酮基生成含氧类胡萝卜素，可作用于lycopene和四脱氢番茄红素等底物。 |
| 大肠杆菌（E. coli） | C40类胡萝卜素途径 | crtO | CrtO（carotene ketolase） | 催化 | 酮化酶，催化β-胡萝卜素形成角黄素等，也可作用于torulene生成4-酮-圆酵母红素。 |
| 大肠杆菌（E. coli） | C40类胡萝卜素途径 | crtU | CrtU（carotene desaturase） | 催化 | 催化β-胡萝卜素芳构化生成isorenieratene，也可作用于torulene生成不对称芳香类胡萝卜素。 |
| 大肠杆菌（E. coli） | C40类胡萝卜素途径 | crtZ | CrtZ（carotene hydroxylase） | 催化 | 羟化酶，催化β-胡萝卜素转化为玉米黄质，也能羟化torulene生成hydroxytorulene。 |
| 大肠杆菌（E. coli） | C40类胡萝卜素途径 | crtX | CrtX（zeaxanthin glycosylase） | 催化 | 糖基转移酶，催化玉米黄质糖基化，也能作用于torulene生成torulene glucoside。 |
| 大肠杆菌（E. coli） | C35类胡萝卜素途径 | crtM（突变体） | CrtM变体 | 催化 | 通过突变使CrtM获得C35合成能力，催化FPP与GGPP异源缩合生成apophytoene。 |
| 大肠杆菌（E. coli） | C45/C50类胡萝卜素途径 | crtM（突变体） | CrtM变体 | 催化 | 通过突变使CrtM能够利用C20和C25前体合成C45（isopentenylphytoene）和C50（diisopentenylphytoene）骨架。 |
| 大肠杆菌（E. coli） | C50类胡萝卜素途径 | crtEb | CrtEb | 催化 | 具有异戊烯基转移酶基序，催化lycopene通过C45中间体添加两个C5单元生成C50骨架。 |
| 大肠杆菌（E. coli） | C50类胡萝卜素途径 | crtYe/crtYf | CrtYe/CrtYf | 催化 | 异二聚体环化酶，接受C45和C50类胡萝卜素为底物，催化环化生成decaprenoxanthin。 |
| 大肠杆菌（E. coli） | 类异戊二烯前体途径 | crtE | CrtE（GGDP synthase） | 催化 | 催化FPP生成GGPP，为C40和C35途径提供前体。 |
关键发现
- 自然界已表征至少700种类胡萝卜素
- CrtN在重组E. coli中可将diapophytoene脱氢4步合成diapolycopene，而天然C30途径通常为3步脱氢生成diaponeurosporene
- CrtM的F26L/F26S单碱基替换使其获得C40合酶活性，W38G和E180G也具有相同效果
- CrtM变体可异源缩合FPP与GGPP产生C35骨架apophytoene，并利用C20/C25前体产生C45骨架isopentenylphytoene和C50骨架diisopentenylphytoene
- C35途径中CrtN的脱氢步数可达4-5步，高于其天然C30途径的3-4步
- 通过途径延伸共获得9种新的C30/C40类胡萝卜素结构及1种推测的C35类胡萝卜素。
研究结论
通过工程改造上游合成酶和利用下游混杂修饰酶，可以有效延伸天然类胡萝卜素途径并构建新的非天然途径，产生大量结构新颖的类胡萝卜素，有望将类胡萝卜素的多样性提高一倍甚至两倍。