Superior thermotolerance of Saccharomyces cerevisiae for efficient bioethanol fermentation can be achieved by overexpression of RSP5 ubiquitin ligase
- 作者
- Hosein Shahsavarani, Minetaka Sugiyama, Yoshinobu Kaneko, Boonchird Chuenchit, Satoshi Harashima
- 单位
- Department of Biotechnology, Graduate School of Engineering, Osaka University; Department of Biotechnology, Faculty of Science, Mahidol University
- 杂志
- Biotechnology Advances（2011）
- DOI
- 10.1016/j.biotechadv.2011.09.002
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
同时糖化和发酵（SSF）过程中，纤维素酶水解最适温度（约50°C）与酿酒酵母乙醇发酵最适温度（30–35°C）不匹配，导致高温下发酵效率低，需要开发耐高温酵母菌株。
研究策略
从耐高温野生菌株C3723中通过经典遗传分析和基因克隆鉴定HTG6为RSP5；通过序列比较、嵌合等位基因构建、实时定量PCR和Western blot分析，阐明RSP5-C等位基因（启动子区5个碱基变化）通过增强转录和蛋白质泛素化提高耐热性；并通过过表达RSP5验证其对耐热性的增强作用。
核心内容
本研究针对同步糖化发酵中纤维素酶最适水解温度（约50°C）与酿酒酵母乙醇发酵最适温度（30–35°C）不匹配的问题，从耐高温野生菌株C3723中通过经典遗传分析鉴定出耐热基因HTG6为编码E3泛素连接酶的RSP5。通过序列比较和嵌合等位基因构建，发现RS5-C等位基因启动子区5个碱基变化是耐热表型的主要决定因素，能显著增强RSP5转录水平并提高蛋白质泛素化。研究进一步通过过表达实验证明，过表达野生型RSP5即可使不耐热菌株在41°C恢复生长，而过表达RSP5-C可进一步将耐热上限提升至43°C。此外，RSP5-C还赋予菌株对乙醇、渗透压、氧化、DNA损伤及细胞壁应激的交叉耐受性。该发现揭示了泛素化修饰在酵母高温适应中的关键作用，为通过过表达RSP5简便高效地构建耐高温工业菌株、实现高温乙醇发酵提供了可行策略。
创新点
['鉴定出新的RSP5-C等位基因，其启动子区5个碱基变化是耐热表型的主要决定因素，可使RSP5转录水平升高并增强蛋白质泛素化。', '首次证明过表达RSP5（野生型等位基因）即可赋予41°C耐热性，在Htg+菌株中过表达RSP5-C可将耐热上限提高至43°C。', 'RSP5-C等位基因还赋予对乙醇、渗透压、氧化、DNA损伤及细胞壁应激的交叉耐受性。']
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae C3723（热带果实分离的野生型Htg+菌株） | 泛素-蛋白酶体降解通路 | RSP5 (HTG6) | Rsp5 E3 ubiquitin ligase | 催化 | RSP5-C等位基因：启动子区5个碱基变化增强转录 |
| Saccharomyces cerevisiae HE120-12A（htg6宿主菌株，Htg-） | 高温应激响应 | RSP5-BY (野生型等位基因) | Rsp5 E3 ubiquitin ligase | 催化 | 过表达RSP5-BY可在41°C恢复生长 |
| Saccharomyces cerevisiae HB8-3A（Htg+） | 泛素-蛋白酶体降解通路 | RSP5-C | Rsp5 E3 ubiquitin ligase | 催化 | 过表达RSP5-C可将耐热性提升至43°C |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 (Htg-) | DNA损伤修复 | RSP5 | Rsp5 ubiquitin ligase | 调控 | RSP5-C增强对hydroxyurea的耐受性，可能通过调节Rnr2定位 |
关键发现
- ['RSP5-C等位基因在启动子区有5个碱基变化、ORF有1个沉默突变、终止子区有2个碱基变化，且启动子区碱基变化主要决定Htg+表型。', '在30°C和41°C条件下，RSP5-C的mRNA转录水平均显著高于RSP5-BY
- 含RSP5-C的菌株在41°C可连续生长，而含RSP5-BY的菌株不能。', '过表达野生型RSP5（pOVRSP5-B）可使Htg-菌株HE120-12A在41°C下恢复生长，而过表达RSP5-C（pOVRSP5-C）可使Htg+菌株HB8-3A在43°C下生长（YPGal培养基）。', '在41°C热激2h后，Htg+菌株HB8-3A总泛素化蛋白水平高于Htg-菌株（BY4742和HE120-12A），表明增强的泛素化与耐热性相关。', 'RSP5-C等位基因赋予对100 μg/ml Congo red、200 μM CdSO4、0.3 M hydroxyurea、12%乙醇、0.5 M NaCl以及55°C热激5min的耐受性。', '采用0.3 M hydroxyurea时RSP5-C显著提高DNA损伤耐受性，但0.08% EMS下无显著差异。']
研究结论
RSP5编码E3泛素连接酶，其新等位基因RSP5-C通过启动子突变增强转录和蛋白质泛素化，赋予酿酒酵母41°C耐热性；过表达RSP5是提高工业酿酒酵母菌株耐热性、实现高温乙醇发酵的简便有效策略。