Genetic modification of critical enzymes and involved genes in butanol biosynthesis from biomass
- 作者
- He Huang, Hui Liu, Yi-Ru Gan
- 单位
- Department of Biochemical Engineering, School of Chemical Engineering and Technology, Key Laboratory of Systems Bioengineering, Ministry of Education, Tianjin University, Tianjin 300072, China
- 杂志
- Biotechnology Advances（2010）
- DOI
- 10.1016/j.biotechadv.2010.05.015
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何通过基因改造提高ABE发酵中丁醇的产量和比例，解决代谢从酸化向溶剂化转变难以调控以及丁醇产物抑制等经济性问题。
研究策略
系统综述了通过插入、过表达、敲除/敲低ABE发酵途径关键酶基因（如thil、hbd、crt、bcd、aad、bdh、adc、ctfAB等）和调节溶剂耐受相关基因（如spo0A、spoIIE、gldA、groESL等）改造梭菌的策略，同时探讨了利用非粮生物质以及以大肠杆菌和酵母作为异源宿主合成丁醇的进展。
核心内容
该文系统综述了通过基因工程改造梭菌ABE发酵途径以提高丁醇产量与比例的策略。作者梳理了针对硫解酶、丁酰辅酶A脱氢酶、丁醇脱氢酶等关键酶基因的过表达、敲除及反义RNA下调等手段，并总结了增强溶剂耐受性与限制产孢的调控策略。关键结果表明，构建含ace操纵子的重组菌使丙酮、丁醇、乙醇产量分别提高95%、37%和90%；buk失活的PJC4BK菌株产丁醇达16.7 g/L；反义RNA下调ctfB使丁醇/丙酮比从1.83提至4.89；破坏adc基因使丁醇比例升至80.05%。此外，下调spoIIE表达使丁醇产量增加110%，异源表达丁醇合成基因在大肠杆菌中最高产丁醇1184 mg/L，在酵母中仅约2.5 mg/L，远低于梭菌。该综述表明基因改造是提升丁醇生产经济性的有效途径，但异源宿主产量瓶颈与木质纤维素利用问题仍需进一步优化。
创新点
总结了多种基因工程策略（包括反义RNA下调、基因敲除、异源表达等）在提高丁醇产量和比例方面的应用，并评估了不同宿主和底物的潜力。
研究对象（20）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Clostridium acetobutylicum ATCC 824 | ABE发酵（丁醇合成途径） | thil | 乙酰辅酶A乙酰转移酶(THL) | 催化 | 催化两分子乙酰CoA缩合为乙酰乙酰CoA，是丁醇合成的第一个关键酶 |
| Clostridium acetobutylicum ATCC 824 | ABE发酵（丁醇合成途径） | hbd | β-羟基丁酰-CoA脱氢酶(BHB) | 催化 | 催化β-羟基丁酰-CoA脱氢生成乙酰乙酰-CoA |
| Clostridium acetobutylicum ATCC 824 | ABE发酵（丁醇合成途径） | crt | 3-羟基丁酰-CoA脱水酶(CRT/巴豆酸酶) | 催化 | 催化β-羟基丁酰-CoA脱水生成巴豆酰-CoA |
| Clostridium acetobutylicum ATCC 824 | ABE发酵（丁醇合成途径） | bcd-etfB-etfA | 丁酰-CoA脱氢酶(BCD) | 催化 | 催化巴豆酰-CoA还原为丁酰-CoA |
| Clostridium acetobutylicum ATCC 824 | ABE发酵（丁醇合成途径） | aad | 丁醛脱氢酶(BAD/双功能醇醛脱氢酶) | 催化 | 催化丁酰-CoA生成丁醛，兼有乙醛脱氢酶活性 |
| Clostridium acetobutylicum ATCC 824 | ABE发酵（丁醇合成途径） | bdhAB | 丁醇脱氢酶(BDH) | 催化 | 催化丁醛还原为丁醇，是丁醇合成的最后一步 |
| Clostridium acetobutylicum ATCC 824 | 乙酸合成途径 | pta | 磷酸转乙酰酶(PTA) | 催化 | 催化乙酰-CoA生成乙酰磷酸 |
| Clostridium acetobutylicum ATCC 824 | 乙酸合成途径 | ack | 乙酸激酶(AK) | 催化 | 催化乙酰磷酸生成乙酸并产生ATP |
| Clostridium acetobutylicum ATCC 824 | 丁酸合成途径 | ptb | 磷酸转丁酰酶(PTB) | 催化 | 催化丁酰-CoA生成丁酰磷酸 |
| Clostridium acetobutylicum ATCC 824 | 丁酸合成途径 | buk | 丁酸激酶(BK) | 催化 | 催化丁酰磷酸生成丁酸并产生ATP；PJC4BK菌株中buk失活 |
| Clostridium acetobutylicum EA 2018 | 丙酮合成途径 | adc | 乙酰乙酸脱羧酶(AADC) | 催化 | 破坏adc基因将丁醇比例从70%提高到80.05%，丙酮降至约0.21 g/L |
| Clostridium acetobutylicum ATCC 824 | 丙酮合成途径 | ctfA-ctfB | CoA转移酶(CoAT) | 催化 | 催化乙酰乙酰-CoA转移CoA给乙酸/丁酸，参与酸摄取；反义RNA下调ctfB可提高丁醇/丙酮比 |
| Clostridium acetobutylicum ATCC 824 | 产孢与溶剂耐受调控 | spo0A | Spo0A转录调控因子 | 调控 | 过表达spo0A可提高丁醇耐受性、延长代谢，但会加速产孢 |
| Clostridium acetobutylicum ATCC 824 | 产孢调控 | spoIIE | SpoIIE磷酸酶 | 调控 | 反义RNA下调spoIIE可延长溶剂生成期，使乙醇、丙酮、丁醇分别增加225%、43%和110% |
| Clostridium acetobutylicum ATCC 824 | 产孢与碳代谢调控 | abrB | AbrB调控蛋白 | 调控 | 产孢抑制因子，与spo0A拮抗，参与碳分解代谢物阻遏 |
| Clostridium acetobutylicum ATCC 824 | 胁迫响应 | groESL | GroEL/GroES热休克蛋白 | 调控 | 过表达groESL可提高溶剂产量和耐受性，延长代谢，改变转录程序 |
| Clostridium beijerinckii NCIMB 8052 | 甘油代谢 | gldA | 甘油脱氢酶 | 催化 | 用反义RNA下调gldA可提高丁醇耐受性 |
| Escherichia coli | 异源丁醇合成途径 | thl, hbd, crt, bcd, etfAB, adhE2 | 硫解酶、β-羟基丁酰-CoA脱氢酶、巴豆酸酶、丁酰-CoA脱氢酶、双功能醇醛脱氢酶 | 催化 | 来自C. acetobutylicum的丁醇合成基因；Atsumi等获得139 mg/L丁醇，Inui等菌株BUT1和BUT2分别产296和1184 mg/L丁醇 |
| Saccharomyces cerevisiae | 异源丁醇合成途径 | 相关梭菌丁醇合成基因 | 相应丁醇合成酶 | 催化 | Steen等通过代谢工程使丁醇产量最高约2.5 mg/L |
| Clostridium acetobutylicum | 纤维素降解 | cipA | CipA脚手架蛋白 | 区室化 | 过表达截短的CipA可在体内形成minicellulosome，为利用纤维素底物提供可能 |
关键发现
- 构建含ace操纵子（pFNK6）的重组C. acetobutylicum使丙酮、丁醇、乙醇产量分别增加95%、37%和90%
- PJC4BK菌株（buk失活）可产丁醇16.7 g/L、丙酮4.4 g/L、乙醇2.6 g/L
- 通过反义RNA下调ctfB使丁醇/丙酮比从1.83提高至4.89，但乙醇浓度提高23倍
- 破坏adc基因使丁醇比例从70%提高到80.05%，丙酮降至约0.21 g/L
- 插入CAC0003和CAC1869基因使丁醇耐受性分别提高13%和81%
- 下调spoIIE表达使乙醇、丙酮、丁醇产量分别增加225%、43%和110%
- 在E. coli中异源表达梭菌丁醇合成基因最高产丁醇1184 mg/L（菌株BUT2），在S. cerevisiae中最高产丁醇约2.5 mg/L
- AADC活性在产溶剂细胞（4.93 U/mg）中比产酸细胞（0.13 U/mg）高40倍。
研究结论
基因改造是提高丁醇产量和生产比例的有效手段，具体包括四种策略：改造关键酶基因、增强菌株溶剂耐受性、引入外源酶系降解廉价底物、限制或延迟产孢。尽管C. acetobutylicum不能高效利用纤维素和半纤维素，但通过异源表达纤维素酶和脚手架蛋白有望改善；同时大肠杆菌和酵母作为异源宿主已初步实现丁醇生产，但产量远低于梭菌。未来需要进一步优化遗传工具和发酵工艺。