Development of yeast cell factories for consolidated bioprocessing of lignocellulose to bioethanol through cell surface engineering
- 作者
- Tomohisa Hasunuma, Akihiko Kondo
- 单位
- Organization of Advanced Science and Technology, Kobe University; Department of Chemical Science and Engineering, Graduate School of Engineering, Kobe University
- 杂志
- Biotechnology Advances（2011）
- DOI
- 10.1016/j.biotechadv.2011.10.011
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
构建用于木质纤维素整合生物加工（CBP）生产乙醇的酵母细胞工厂，需要同时解决木质纤维素降解酶的表达、戊糖利用及发酵抑制物耐受性等问题。
研究策略
采用细胞表面展示技术在酵母表面展示纤维素酶和半纤维素酶，结合木糖代谢工程（引入XR/XDH/XK或木糖异构酶）以及进化工程和系统生物学指导的代谢工程来提高发酵抑制物耐受性。
核心内容
该综述系统梳理了利用细胞表面展示技术构建酵母细胞工厂、实现木质纤维素整合生物加工（CBP）直接产乙醇的研究进展。核心策略是在酿酒酵母表面展示纤维素酶（如EGII、CBHII、BGL1）和半纤维素酶，实现大分子底物的胞外降解，同时引入木糖代谢途径（XR/XDH/XK或木糖异构酶）并借助进化工程与系统生物学手段（转录组、代谢组、disruptome筛选）解析并增强发酵抑制物耐受性。多个重组菌株实现了一步发酵：如共展示BGL1和EGII的菌株从45 g/L大麦β-葡聚糖产16.5 g/L乙醇，产率达理论值的93.3%；共展示XYNII和β-木糖苷酶并表达XR/XDH/XK的菌株从100 g/L桦木木聚糖产7.1 g/L乙醇；过表达ZWF1等磷酸戊糖途径基因可增强糠醛耐受性，进化工程适应菌株在蒸汽预处理麦秆发酵中乙醇浓度提高20%、木糖消耗提高65%。结果表明，细胞表面展示技术结合木糖代谢与耐受性工程，是构建高效CBP酵母的可行路线，为木质纤维素生物乙醇的工业化生产提供了重要基础。
创新点
系统性地综述了细胞表面展示技术在CBP酵母开发中的应用，包括迷你纤维素小体展示；通过进化工程和系统生物学方法（如disruptome筛选、转录组学、代谢组学）揭示抑制物耐受机制并指导菌株改造。
研究对象（22）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | 纤维素降解 | bgl1 | β-葡萄糖苷酶（BGL1） | 催化 | 来源于Aspergillus aculeatus，细胞表面展示 |
| Saccharomyces cerevisiae | 纤维素降解 | egII | 内切葡聚糖酶（EGII） | 催化 | 来源于Trichoderma reesei，细胞表面展示 |
| Saccharomyces cerevisiae | 纤维素降解 | cbhII | 纤维二糖水解酶（CBHII） | 催化 | 来源于Trichoderma reesei，细胞表面展示 |
| Saccharomyces cerevisiae | 半纤维素降解 | xyn2 | 内切木聚糖酶（XYNII） | 催化 | 来源于Trichoderma reesei，细胞表面展示 |
| Saccharomyces cerevisiae | 半纤维素降解 | xylA | β-木糖苷酶 | 催化 | 来源于Aspergillus oryzae，细胞表面展示 |
| Saccharomyces cerevisiae | 木糖代谢 | XYL1 (XR) | 木糖还原酶（XR） | 催化 | 来源于Scheffersomyces stipitis，胞内表达 |
| Saccharomyces cerevisiae | 木糖代谢 | XYL2 (XDH) | 木糖醇脱氢酶（XDH） | 催化 | 来源于Scheffersomyces stipitis，胞内表达 |
| Saccharomyces cerevisiae | 木糖代谢 | XKS1 (XK) | 木酮糖激酶（XK） | 催化 | 来源于Saccharomyces cerevisiae，胞内表达 |
| Saccharomyces cerevisiae | 纤维二糖/纤维寡糖转运 | cdt-1 | 纤维寡糖转运蛋白 | 转运 | 来源于Neurospora crassa，与胞内β-葡萄糖苷酶协同 |
| Saccharomyces cerevisiae | 抑制剂解毒（糠醛/5-HMF还原） | ADH6 | NADPH依赖性乙醇脱氢酶 | 催化 | 催化5-HMF还原为FDM，过表达增强耐受 |
| Saccharomyces cerevisiae | 抑制剂解毒（糠醛/5-HMF还原） | ADH7 | NADH依赖性醇脱氢酶 | 催化 | 具有还原糠醛和5-HMF活性，过表达提高耐受 |
| Saccharomyces cerevisiae | 抑制剂解毒（醛类还原） | AR11 | NADPH依赖性醛还原酶 | 催化 | 还原至少14种醛类，包括糠醛、5-HMF、香草醛等 |
| Saccharomyces cerevisiae | 抑制剂解毒（酚类氧化） | laccase | 漆酶 | 催化 | 来源于Trametes versicolor，异源表达，转化松柏醛 |
| Saccharomyces cerevisiae | 抑制剂解毒（苯丙烯酸脱羧） | PAD1 | 苯丙烯酸脱羧酶（Pad1p） | 催化 | 过表达提高阿魏酸和肉桂酸耐受性 |
| Saccharomyces cerevisiae | 磷酸戊糖途径 | ZWF1 | 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 | 催化 | 过表达增加NADPH供应，提高糠醛耐受性 |
| Saccharomyces cerevisiae | 磷酸戊糖途径 | GND1, RPE1, TKL1 | 6-磷酸葡糖酸脱氢酶、核酮糖-5-磷酸差向异构酶、转酮醇酶 | 催化 | 这些基因缺失导致糠醛还原能力下降，说明PPP途径在耐受中发挥作用 |
| Saccharomyces cerevisiae | 抑制物耐受调控 | YAP1, PDR1, PDR3, RPN4, HSF1 | 转录因子/调控蛋白 | 调控 | 在HMF适应过程中的关键调控基因，参与基因组适应 |
| Saccharomyces cerevisiae | 质子转运 | PMA1 | 质膜H+-ATPase（Pma1p） | 转运 | 泵出质子，补偿弱酸引起的胞内酸化，消耗ATP |
| Saccharomyces cerevisiae | 细胞表面展示 | SAG1 | α-凝集素（锚定蛋白） | 区室化 | 用于将纤维素酶和半纤维素酶锚定于细胞表面 |
| Saccharomyces cerevisiae | 迷你纤维素小体组装 | scaffoldin, dockerin, cohesin | 脚手架蛋白、对接模块（dockerin）、 cohesin模块 | 区室化 | 通过cohesin-dockerin相互作用将多种纤维素酶组装在细胞表面，增强协同作用 |
| Kluyveromyces marxianus | 纤维素降解 | egII, bgl1 | 内切葡聚糖酶EGII、β-葡萄糖苷酶BGL1 | 催化 | 细胞表面展示，可在48°C高温下发酵β-葡聚糖产乙醇 |
| Hansenula polymorpha | 半纤维素降解 | xyn2, xlnD | 内切木聚糖酶、β-木糖苷酶 | 催化 | 分泌表达，可在48°C以桦木木聚糖为碳源产乙醇 |
关键发现
- 综述中多个重组酵母菌株实现了直接发酵纤维素/半纤维素产乙醇：Fujita等（2002）共展示BGL1和EGII的酿酒酵母从45 g/L大麦β-葡聚糖产16.5 g/L乙醇，产率0.48 g/g（理论产率的93.3%）
- Fujita等（2004）共展示EGII、CBHII和BGL1的菌株从10 g/L PASC产2.9 g/L乙醇，产率0.45 g/g（88.5%）
- den Haan等（2007b）分泌EGII和BGL1的菌株从10 g/L PASC产1.0 g/L乙醇，细胞干重达0.27 g/L
- Katahira等（2004）共展示XYNII和β-木糖苷酶并表达XR/XDH/XK的菌株从100 g/L桦木木聚糖产7.1 g/L乙醇，产率0.30 g/g
- Yamada等（2011）优化纤维素酶表达的二倍体菌株从20 g/L PASC产7.6 g/L乙醇，从100 g/L预处理稻草产7.5 g/L乙醇
- Apiwatanapiwat等（2011）在K. marxianus表面展示EGII和BGL1，从10 g/L大麦β-葡聚糖产4.24 g/L乙醇
- Sakamoto等（2011）共展示BGL、β-木糖苷酶和木聚糖酶的XR/XDH/XK菌株从水稻秸秆热水解液产乙醇，产率0.41 g/g（理论产率的82%）
- 另外，过表达ZWF1等磷酸戊糖途径基因可提高糠醛耐受性，过表达AR11的菌株在20 mM糠醛和40 mM 5-HMF存在下生长优于野生型
- 进化工程适应菌株在蒸汽预处理麦秆发酵中乙醇浓度提高20%、木糖消耗提高65%。
研究结论
细胞表面展示技术能够使酿酒酵母等酵母有效降解纤维素和半纤维素并直接发酵产乙醇，是实现CBP的可行策略；结合木糖代谢工程和抑制物耐受性工程（如进化工程、系统生物学指导的基因改造），可显著提升酵母在木质纤维素水解液中的发酵性能，为工业化生物乙醇生产提供潜力。