Impacts of calcium signal transduction on the fermentation production of antitumor ganoderic acids by medicinal mushroom Ganoderma lucidum
- 作者
- Yi-Ning Xu, Jian-Jiang Zhong
- 单位
- 上海交通大学生命科学与生物技术学院微生物代谢国家重点实验室及分子生物化工实验室
- 杂志
- Biotechnology Advances（2011）
- DOI
- 10.1016/j.biotechadv.2011.10.001
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
灵芝酸（GAs）产量低是限制其广泛应用的主要瓶颈，且外源钙信号调控灵芝三萜生物合成的分子机制尚不清楚。
研究策略
在灵芝静置液体培养中于不同时间添加不同浓度CaCl₂，并联合使用钙调蛋白抑制剂氯丙嗪和钙调磷酸酶抑制剂环孢素A，通过qRT-PCR分析钙信号传感基因（cam、cna、crz1）及GA生物合成基因（hmgr、sgs、ls）的转录水平，探究钙信号转导对GA合成的影响。
核心内容
本研究以灵芝静置液体培养体系为对象，系统探究外源钙信号转导对灵芝酸（GAs）发酵生产的调控作用。通过在不同时间点添加不同浓度CaCl₂，并联合使用钙调蛋白抑制剂氯丙嗪和钙调磷酸酶抑制剂环孢素A，结合qRT-PCR分析，发现第2天添加10 mM CaCl₂效果最佳，总粗灵芝酸含量在第12天达86.45±5.24 mg/g干重，总灵芝酸、GA-Mk、GA-T、GA-S、GA-Me含量分别提高3.7、2.6、4.5、3.2、3.8倍。抑制剂实验证实，100 μM氯丙嗪和15 μM环孢素A可显著降低GA产量，其中GA-Me分别下降67%和72%。机制研究表明，Ca²⁺添加上调钙信号传感基因cam、cna、crz1及合成基因hmgr、sgs、ls的转录，且生物信息学预测到sgs和ls启动子含钙调磷酸酶依赖性响应元件（CDRE），孢子数变化与GA产量趋势一致。该研究首次在担子菌中证明钙调磷酸酶信号通路参与三萜生物合成调控，提出外源钙离子经钙调蛋白-钙调磷酸酶-CRZ1-CDRE途径上调GA合成基因的模型，为真菌次级代谢产物的信号转导工程强化提供了简单有效的范例。
创新点
['首次在担子菌门真菌（灵芝）中证明钙调磷酸酶信号通路参与三萜类灵芝酸生物合成的调控', '提出外源钙离子通过钙调蛋白-钙调磷酸酶-CRZ1-CDRE途径在转录水平上调GA生物合成基因的模型', '建立添加10mM CaCl₂这一简单高效的灵芝酸发酵强化策略，产量提升幅度优于以往报道']
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Ganoderma lucidum CGMCC 5.616 | 甲羟戊酸/异戊二烯途径（灵芝酸生物合成） | hmgr | 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 (HMGR) | 催化 | 甲羟戊酸途径的限速酶 |
| Ganoderma lucidum CGMCC 5.616 | 甲羟戊酸/异戊二烯途径（灵芝酸生物合成） | sgs | 角鲨烯合酶 (SQS) | 催化 | 三萜/甾醇生物合成途径的第一个特异性酶 |
| Ganoderma lucidum CGMCC 5.616 | 甲羟戊酸/异戊二烯途径（灵芝酸生物合成） | ls | 羊毛甾醇合酶 (LS) | 催化 | 催化羊毛甾烷三萜骨架的形成 |
| Ganoderma lucidum CGMCC 5.616 | 钙信号转导通路 | cam | 钙调蛋白 (CaM) | 调控 | 钙离子传感器，激活钙调磷酸酶 |
| Ganoderma lucidum CGMCC 5.616 | 钙信号转导通路 | cna | 钙调磷酸酶亚基A (CnA) | 调控 | 丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白磷酸酶，受Ca²⁺/钙调蛋白复合物激活 |
| Ganoderma lucidum CGMCC 5.616 | 钙信号转导通路 | crz1 | 钙调磷酸酶响应锌指转录因子 (CRZ1) | 调控 | 结合CDRE基序激活下游基因转录 |
关键发现
- ['在静置液体培养中添加10mM CaCl₂，总灵芝酸、GA-Mk、GA-T、GA-S、GA-Me含量分别提高3.7、2.6、4.5、3.2、3.8倍', '第2天添加10mM CaCl₂时产量最高，总粗灵芝酸含量达86.45±5.24 mg/g DW（第12天），孢子数也最多', '100μM氯丙嗪处理使总GA、GA-Mk、GA-T、GA-S、GA-Me在16天时分别降低18%、55%、31%、31%、67%
- 15μM环孢素A分别降低14%、72%、81%、69%、72%', 'Ca²⁺添加上调cam、cna、crz1、hmgr、sgs、ls的转录水平，而抑制剂处理下调这些基因的表达，Ca²⁺补充可部分恢复表达', '通过生物信息学分析在sgs和ls启动子中预测到钙调磷酸酶依赖性响应元件（CDRE）基序', '孢子数变化趋势与总GA含量一致，提示钙调磷酸酶信号可能通过影响无性产孢进而调控GA合成']
研究结论
外源钙离子通过钙调蛋白依赖的钙调磷酸酶信号通路，在转录水平上调灵芝酸生物合成基因，从而显著提高抗肿瘤灵芝酸产量；该策略简单有效，为蘑菇培养中通过信号转导工程提高次级代谢产物产量提供了范例。