Biosynthetic approaches to creating bioactive fungal metabolites: Pathway engineering and activation of secondary metabolism
- 作者
- Takayuki Motoyama, Hiroyuki Osada
- 单位
- RIKEN CSRS, 2-1 Hirosawa, Wako-shi, Saitama 351-0198, Japan
- 杂志
- Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters（2017）
- DOI
- 10.1016/j.bmcl.2016.11.013
- 所属领域
- 代谢工程与合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
富含sp3碳的真菌次级代谢产物如fumitremorgin C和terpendole E等生物活性强但化学合成困难，野生菌株产量不稳定，且多数次级代谢基因簇在实验室条件下表达极差，难以获得足够量进行活性研究和结构改造。
研究策略
以fumitremorgin C和terpendole E为对象进行生物合成基因簇的路径工程改造，通过基因敲除阻断代谢分支实现目标化合物稳定过量生产，并分离新类似物；以tenuazonic acid为例，通过干扰双组分信号系统激活沉默次级代谢，鉴定新的NRPS-PKS杂合酶TAS1。
核心内容
该研究聚焦于真菌次级代谢产物的生物合成途径工程与沉默基因簇激活策略。以烟曲霉中fumitremorgin类化合物和Tolypocladium album中terpendole类吲哚二萜为对象，通过基因敲除阻断代谢分支实现目标产物的稳定过量生产。研究发现FtmE介导的C环环化是赋予BCRP抑制活性的关键步骤，而敲除双特异性P450基因terP后，terpendole E得以稳定积累，并分离出新化合物11-酮基paspaline，其对HeLa细胞毒性IC50为2.9 μM，对kinesin Eg5的抑制活性较terpendole E提高约两倍，且对已知抑制剂耐药的突变体仍有效。此外，通过干扰双组分信号系统成功激活了沉默的tenuazonic acid生物合成，鉴定出首个真菌NRPS-PKS杂合酶TAS1，其结构域排列为C-A-PCP-KS，与经典方向相反，并阐明其独特环化机制。该工作表明途径工程与次级代谢激活相结合可稳定生产目标天然产物、获得活性更强的类似物，并为发掘隐性代谢产物提供了有效策略。
创新点
['通过敲除双特异性P450基因terP，阻断terpendole E的代谢转化和paspaline的分流，首次实现terpendole E的稳定过量生产。', '阐明terpendole E生物合成途径，发现TerQ同时具有C11和C13羟化活性，并提出paxilline类吲哚二萜在Sordariomycetes和Eurotiomycetes中存在两条不同的生物合成途径。', '从terP敲除株获得新氧化类似物11-酮基paspaline，其对kinesin Eg5抑制活性和细胞毒性均强于terpendole E。', '首次报道真菌NRPS-PKS杂合酶TAS1，其结构域排列为C-A-PCP-KS，与经典真菌PKS-NRPS相反，并阐明其催化TeA合成的独特环化机制。', '通过干扰双组分信号系统成功激活沉默的次级代谢，稳定产生tenuazonic acid，证实该策略可用于发掘隐性代谢产物。']
研究对象（13）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Aspergillus fumigatus BM939 | fumitremorgin生物合成 | ftmA | FtmA | 催化 | 非核糖体肽合成酶(NRPS)，负责二酮哌嗪骨架的合成 |
| Aspergillus fumigatus BM939 | fumitremorgin生物合成 | ftmE | FtmE | 催化 | 介导C环环化，是BCRP抑制活性的关键步骤 |
| Aspergillus fumigatus BM939 | fumitremorgin生物合成 | ftmF | FtmF | 催化 | α-KG依赖性双加氧酶，催化化合物9的过氧桥键形成 |
| Aspergillus fumigatus BM939 | fumitremorgin生物合成 | ftmD | FtmD | 催化 | 推测参与化合物5的甲基化，该步骤未经实验证实 |
| Tolypocladium album | terpendole/吲哚二萜生物合成 | terP | TerP | 催化 | 双特异性P450单加氧酶，催化terpendole E生成13-脱氧terpendole I，也可将paspaline转化为13-脱氧paxilline |
| Tolypocladium album | terpendole/吲哚二萜生物合成 | terQ | TerQ | 催化 | P450单加氧酶，兼具C11和C13羟化活性，在terpendole生物合成中催化两步反应 |
| Tolypocladium album | terpendole/吲哚二萜生物合成 | terK | TerK | 催化 | P450单加氧酶 |
| Tolypocladium album | terpendole/吲哚二萜生物合成 | terM | TerM | 催化 | FAD依赖性单加氧酶 |
| Tolypocladium album | terpendole/吲哚二萜生物合成 | terB | TerB | 催化 | 萜烯环化酶 |
| Tolypocladium album | terpendole/吲哚二萜生物合成 | terC | TerC | 催化 | 异戊二烯基转移酶 |
| Tolypocladium album | terpendole/吲哚二萜生物合成 | terF | TerF | 催化 | 异戊二烯基转移酶，与lolitrem B产生菌的ltmF同源 |
| — | tenuazonic acid (TeA)生物合成 | TAS1 | TAS1 (tenuazonic acid synthetase 1) | 催化 | 首个报道的真菌NRPS-PKS杂合酶，结构域排列为C-A-PCP-KS；以异亮氨酸和乙酰乙酰-CoA为底物，独特KS域催化最终环化释出TeA |
| Aspergillus oryzae | 吲哚二萜生物合成 | — | — | 催化 | 作为异源宿主成功生产paxilline、aflatrem、penitrem A等吲哚二萜化合物，其本身含aflatrem基因簇但atmQ存在关键突变 |
关键发现
- ['FTM-C (1)是BCRP/ABCG2的强效特异性抑制剂，活性等级为+++；demethoxyFTM-C (4)活性为++；12α,13α-dihydroxyFTM-C (7)为+；FTM-B (8)为+；verruculogen (9)为+。FTM-B (8)细胞毒性IC50为5-15 μM，verruculogen (9)为20-30 μM，其他中间体无细胞毒性。', 'FtmE介导的C环环化是赋予BCRP抑制活性的最关键步骤，环化后产物FTM-C (1)活性最强，而进一步修饰生成FTM-B (8)后BCRP活性减弱但出现细胞毒性。', 'Terpendole E是首个发现的天然kinesin Eg5抑制剂。其生物合成中TerQ催化paspaline的C11羟化生成terpendole E，TerP为双特异性P450，将terpendole E转化为13-deoxyterpendole I（新化合物），同时将paspaline转化为分流产物13-deoxypaxilline。', '敲除terP基因后，terpendole E实现稳定过量生产，并在长期培养中积累新化合物11-酮基paspaline (20)。', '11-酮基paspaline (20)对HeLa细胞的细胞毒性IC50为2.9 μM（terpendole E为12.1 μM），对kinesin Eg5微管刺激ATPase活性抑制IC50为16.5 ±
- 3 μM（terpendole E为34.7 ±
- 6 μM），对kinesin-1均无抑制（IC50>100 μM），表明C11酮基显著增强对Eg5的抑制作用。', 'terpendole E和11-酮基paspaline与已知Eg5抑制剂GSK-1和STLC的机制不同，对GSK-1/STLC耐药的Eg5突变体仍有效。', 'TAS1是首个报道的真菌NRPS-PKS杂合酶，结构域排列为C-A-PCP-KS，以异亮氨酸和乙酰乙酰-CoA为底物合成tenuazonic acid，其独特KS域催化最终环化步骤，与经典PKS-NRPS方向相反。']
研究结论
生物合成途径是制备复杂含sp3碳天然产物的重要手段，尤其适用于化学合成困难的化合物如FTM-C和terpendole E。通过途径工程和次级代谢激活，不仅能稳定生产目标产物，还能获得结构多样的生物合成中间体与分流代谢物，有些具有更强的生物活性，如11-酮基paspaline。将途径工程、次级代谢激活与独特酶的应用相结合，将极大促进多样性天然产物的创制和药物先导物的发现。