高级醇 · 代谢工程文献库

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Functional analyses of cytochrome P450 genes responsible for the early steps of brassicicene C biosynthesis

作者
Makoto Hashimoto, Yusuke Higuchi, Shunji Takahashi, Hiroyuki Osada, Toshiyuki Sakaki, Tomonobu Toyomasu, Takeshi Sassa, Nobuo Kato, Tohru Dairi
单位
Biotechnology Research Center, Toyama Prefectural University; The Institute of Scientific and Industrial Research, Osaka University; Antibiotics Laboratory and Chemical Biology Department, RIKEN; Department of Bioresource Engineering, Yamagata University
杂志
Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters（2009）
DOI
10.1016/j.bmcl.2009.08.026
所属领域
合成生物学
关键词
BiosynthesisBrassicicene CCytochrome P450Diterpene
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解决的核心问题

解析芸苔链格孢菌中brassicicene C生物合成早期步骤中细胞色素P450酶的功能，即fuscocadiene（FD）生成后先后的羟基化反应由哪些P450催化。

研究策略

在酿酒酵母中异源表达brassicicene C基因簇中的五个P450基因（orf1, orf2, orf5, orf7, orf11）与细胞色素P450还原酶基因，通过共表达FD合酶基因，结合产物分离和结构鉴定，确定各P450的功能。

研究路线图

100%
研究问题：P450酶催化brassicicene C早期合成步骤
策略：酿酒酵母异源表达基因簇+CPR
关键改造：ADH启动子替换提升产量
结果：鉴定Orf1→FD 8β-醇，Orf7→16-羟基化
结论：早期为FD→8β-醇→8β,16-二醇
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核心内容

该研究在酿酒酵母中系统解析了芸苔链格孢菌brassicicene C生物合成早期步骤中两个细胞色素P450酶的功能。作者将基因簇中五个P450基因（orf1、orf2、orf5、orf7、orf11）与P450还原酶基因共表达于携带fuscocadiene（FD）合酶基因的酵母底盘，通过产物分离和结构鉴定确定各酶催化步骤。结果显示Orf1催化FD的8β-羟基化生成FD 8β-醇，Orf7进一步催化该中间体的16-羟基化生成FD 8β,16-二醇，由此明确了brassicicene C合成的早期顺序为FD→FD 8β-醇→FD 8β,16-二醇。通过将天然启动子替换为ADH启动子，FD产量提升至约5 mg/L，较原启动子提高80倍；引入Orf1后FD 8β-醇积累约1 mg/L，较仅产FD的转化提高约120倍。经26 L大规模培养纯化获得0.5 mg终产物FD 8β,16-二醇。该工作首次确定了这两个P450酶的底物特异性和催化顺序，为完整重构brassicicene C生物合成途径及后续工程化改造奠定了基础。

创新点

首次明确了Orf1和Orf7分别催化FD的8β-羟基化和FD 8β-醇的16-羟基化；通过ADH启动子替换使FD产量提高80倍，FD 8β-醇产量提高约120倍。

研究对象（4）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Saccharomyces cerevisiae YPH500 brassicicene C生物合成 orf8 fuscocadiene (FD) synthase (Orf8) 催化 催化GGDP环化生成fuscocadiene，已由Minami等鉴定（文献18）
Saccharomyces cerevisiae YPH500 brassicicene C生物合成 orf1 细胞色素P450单加氧酶Orf1 催化 催化FD的8β-羟基化生成FD 8β-醇
Saccharomyces cerevisiae YPH500 brassicicene C生物合成 orf7 细胞色素P450单加氧酶Orf7 催化 催化FD 8β-醇的16-羟基化生成FD 8β,16-二醇
Saccharomyces cerevisiae YPH500 brassicicene C生物合成 AbP450Red 细胞色素P450还原酶 能量供给 为P450催化提供电子

关键发现

  1. Orf1催化FD生成FD 8β-醇（4），Orf7催化FD 8β-醇生成FD 8β,16-二醇（5）
  2. 在酿酒酵母中，用ADH启动子替换后FD产量约为5 mg/L，比原启动子提高80倍
  3. 引入Orf1后FD 8β-醇积累约1 mg/L，比仅产FD转化提高120倍
  4. orf7与PaP450有47%氨基酸同源性
  5. 经26 L大规模培养纯化获得0.5 mg FD 8β,16-二醇，其HR-ESI-MS m/z为327.2278（[M+Na]+）。

研究结论

brassicicene C生物合成早期步骤为FD→FD 8β-醇→FD 8β,16-二醇，分别由P450酶Orf1和Orf7催化。该基因簇确证参与brassicicene C生物合成。