Substrate specificity of strictosidine synthase
- 作者
- Elizabeth McCoy, M. Carmen Galan, Sarah E. O'Connor
- 单位
- Department of Chemistry, Massachusetts Institute of Technology
- 杂志
- Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters（2006）
- DOI
- 10.1016/j.bmcl.2006.01.098
- 所属领域
- 酶工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
系统定量解析strictosidine synthase的底物识别机制，探索其能否利用非天然底物生成新的生物碱类似物。
研究策略
合成一系列色胺类似物（吲哚环取代、杂原子替换、侧链修饰）及secologanin衍生物，测定酶动力学参数，并测试下游strictosidine β-glucosidase对产物的处理能力。
核心内容
该研究系统定量解析了长春花来源的strictosidine synthase的底物特异性，旨在探索其利用非天然底物生成生物碱类似物的可行性。作者合成了一系列色胺类似物（包括吲哚环取代、杂原子替换和侧链修饰）及secologanin衍生物，测定了酶动力学参数，并检验了产物被下游strictosidine β-glucosidase加工的能力。结果显示，天然底物色胺的Km为7.4 μM，kcat为0.9 min⁻¹；吲哚环4位和7位可耐受氟或甲基取代，而5位和6位取代活性极低或丧失；杂原子替换为苯并呋喃类似物时kcat骤降至0.023 min⁻¹，苯并噻吩类似物几乎无活性；侧链修饰和N-甲基化均导致活性丧失。secologanin甲酯位点的酯交换产物可被转化，但乙烯位引入大基团则无活性。所有生成的strictosidine衍生物均能被下游β-glucosidase加工，其中4-氟和4-甲基产物经双酶串联反应生成了cathenamine类似物。这一结果表明该酶具有有限度的底物容忍性，4、7位和酯基位点是可修饰的潜在工程位点，且该酶与下游葡萄糖苷酶的底物互补性可用于生产多种萜类吲哚生物碱中间体类似物。
创新点
首次对strictosidine synthase的底物特异性进行系统定量分析；发现吲哚环4、7位可耐受取代而5、6位不耐受；证明secologanin的甲酯位点可衍生化；证实该酶与下游葡萄糖苷酶可协同生成生物碱中间体类似物。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 萜类吲哚生物碱生物合成途径 | — | strictosidine synthase (Catharanthus roseus) | 催化 | 异源表达用于活性测定，催化色胺与裂环马钱素发生Pictet-Spengler缩合 |
| Escherichia coli | 萜类吲哚生物碱生物合成途径 | — | strictosidine β-glucosidase (Catharanthus roseus) | 催化 | 下游酶，水解strictosidine衍生物的糖苷键，生成cathenamine类似物 |
关键发现
- 天然底物色胺的Km=7.4 μM，kcat=0.9 min-1，kcat/Km=2030 M-1 s-1
- 苯并呋喃类似物4的Km≈7.7 μM，但kcat降至0.023 min-1
- 苯并噻吩类似物5活性极低
- 4-氟色胺7的Km=42 μM，kcat=0.35 min-1
- 5-氟色胺8和6-氟色胺9的kcat分别仅0.043和0.056 min-1
- 4-甲基色胺11的Km=80 μM，kcat=0.19 min-1
- 7-甲基色胺14的Km=198 μM，kcat=0.29 min-1
- 5-羟基色胺15的Km=1200 μM，kcat=0.096 min-1，活性最弱
- 5-甲基和6-甲基色胺无活性
- N-甲基色胺、3-甲胺基吲哚、3-丙胺基吲哚、吡咯类似物16及组胺17均无活性
- secologanin乙烯位引入大基团（22、23）导致无活性，而甲酯位酯交换产物（24、25）可被转化
- 所有生成的strictosidine衍生物均能被strictosidine β-glucosidase加工，其中4-氟和4-甲基产物经双酶反应生成cathenamine类似物（质谱确认分子量）。
研究结论
strictosidine synthase对吲哚环和侧链具有严格但有限度的容忍性，吲哚环4、7位和secologanin酯基位点可用于衍生化；该酶与下游strictosidine β-glucosidase底物特异性互补，可串联用于生产多种萜类吲哚生物碱中间体类似物。