Cis- and trans-regulatory elements of 3α-hydroxysteroid dehydrogenase/carbonyl reductase as biosensor system for steroid determination in the environment
- 作者
- Guangming Xiong, Yijing Luo, Saihong Jin, Edmund Maser
- 单位
- Institute of Toxicology and Pharmacology for Natural Scientists, University Medical School Schleswig-Holstein, Campus Kiel, Brunswickstr. 10, D-24105 Kiel, Germany
- 杂志
- Chemico-Biological Interactions（2008）
- DOI
- 10.1016/j.cbi.2008.10.012
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
环境中类固醇激素的检测方法昂贵、复杂且灵敏度不足，急需便宜、简便、灵敏的检测系统。
研究策略
利用C. testosteroni中3α-HSD/CR基因hsdA的顺式调控元件（启动子/操纵基因）和反式调控因子（RepA/RepB），将hsdA编码区替换为GFP基因，通过同源重组获得荧光报告菌株CT-GFP5-1；并进一步利用其细胞质构建无细胞检测系统。
核心内容
本研究利用睾酮降解菌睾丸酮丛毛单胞菌中3α-羟类固醇脱氢酶/羰基还原酶基因hsdA的顺式调控元件（启动子/操纵基因）及反式调控因子RepA/RepB，将该基因编码区替换为绿色荧光蛋白（GFP）报告基因，通过同源重组构建了荧光报告菌株CT-GFP5-1。该突变株在类固醇诱导下产生可定量的荧光信号，其中睾酮、雌二醇和胆固醇的检测范围分别为57–450 ng/ml、1.6–12.8 ng/ml和19.3–154.4 ng/ml。进一步利用该菌株细胞质构建了无细胞检测系统，灵敏度较全细胞系统提高2–3个数量级，可检测低至0.029 fg/ml的雌二醇，相当于在50 μl反应体系中约600个分子；氯仿提取回收率约95%，最大荧光信号在30分钟内出现。此外，突变株在OD595=1.0时的荧光强度（RFU 47,674）显著高于野生型（29,605）。该研究首次将hsdA调控系统开发为类固醇生物传感器，无细胞系统兼具高灵敏度和稳定性，为环境中类固醇激素的简便、廉价检测提供了新工具。
创新点
首次构建基于C. testosteroni hsdA调控系统的类固醇生物传感器；无细胞系统灵敏度比细胞系统高2-3个数量级；可检测至fg/ml级别。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Comamonas testosteroni ATCC 11996 | 类固醇降解通路 | hsdA | 3α-羟类固醇脱氢酶/羰基还原酶（3α-HSD/CR） | 催化 | 类固醇降解关键酶，催化类固醇环结构3位羟基/氧基的互变 |
| Comamonas testosteroni CT-GFP5-1 | 类固醇降解通路（hsdA调控区） | gfp | 绿色荧光蛋白（GFP） | 调控 | 报告蛋白，受hsdA上游调控区控制表达，用于类固醇检测 |
| Comamonas testosteroni CT-GFP5-1 | hsdA调控 | repA | RepA | 调控 | 转录阻遏物，结合hsdA上游两个操纵基因序列 |
| Comamonas testosteroni CT-GFP5-1 | hsdA调控 | repB | RepB | 调控 | 翻译阻遏物，结合hsdA mRNA 5'端16核苷酸序列 |
关键发现
- 细胞型生物传感器可检测睾酮57-450 ng/ml、雌二醇1.6-12.8 ng/ml、胆固醇19.3-154.4 ng/ml
- 无细胞型可检测睾酮28-219 pg/ml、雌二醇0.029-0.430 fg/ml、胆固醇9.7-77.2 fg/ml。氯仿提取回收率约95%，最大荧光信号在30分钟出现。无细胞系统可检测0.1 fM雌二醇（2 μl），相当于50 μl反应体积中约600个分子。突变株CT-GFP5-1的荧光信号高于野生型（例如OD595=1.0时RFU 47,674 vs 29,605）。荧光信号在睾酮浓度高于900 ng/ml时因淬灭而下降。
研究结论
成功构建了基于hsdA调控区和GFP的C. testosteroni突变株CT-GFP5-1，细胞型和无细胞型系统均可作为灵敏的类固醇生物传感器，无细胞系统灵敏度更高且可稳定保存，适用于环境中类固醇的测定。