Analysis and characterization of eight estradiol inducible genes and a strong promoter from the steroid degrading marine bacterial strain S19-1
- 作者
- Tingdi Zhang, Guangming Xiong, Edmund Maser
- 单位
- Institute of Toxicology and Pharmacology for Natural Scientists, University Medical School, Schleswig-Holstein, Campus Kiel, Brunswick Str. 10, D-24105 Kiel, Germany
- 杂志
- Chemico-Biological Interactions（2012）
- DOI
- 10.1016/j.cbi.2012.11.018
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
分离和鉴定海洋甾体降解菌 S19-1 中的雌二醇诱导型基因及强启动子，为阐明其雌二醇降解途径和构建高效降解菌株提供基础。
研究策略
采用基于荧光微板检测的底物诱导基因表达筛选（FMA）宏基因组方法，构建 S19-1 染色体 DNA SalI 片段文库，转化大肠杆菌后通过雌二醇诱导前后荧光变化筛选阳性克隆，再经测序、BLAST 分析及缺失突变定位启动子。
核心内容
该研究从海洋甾体降解菌株S19-1中分离并鉴定了多个雌二醇诱导型基因及一个新的强启动子。研究人员采用荧光微板检测的底物诱导基因表达筛选宏基因组方法，构建了S19-1染色体DNA的SalI片段文库并转化大肠杆菌，经雌二醇诱导前后荧光变化筛选出37个阳性克隆。其中6个质粒表现出5.6%至7.3%的诱导效率。对p302进行序列分析后发现了编码GntR转录调控因子的gntRx基因（744 bp，编码247个氨基酸），与柠檬酸杆菌属GntR同源蛋白一致性达81%。进一步通过缺失突变定位，鉴定出一个108 bp的新强启动子，其-10区和-35区分别为TAAGAT和TTGTCG，间距19 bp。该启动子活性虽低于lac启动子，但能驱动EGFP表达使菌落呈现绿色。研究还发现p302衍生质粒可被雌二醇诱导，并编码L-丝氨酸脱氨酶等蛋白。这些结果不仅揭示了S19-1雌二醇降解的调控元件，所鉴定的新启动子也为构建甾体高效降解工程菌株提供了可用的遗传工具。
创新点
1. 应用宏基因组法从海洋新菌株 S19-1 中分离到多个雌二醇诱导基因；2. 鉴定了一个 108 bp 的新强启动子，其 -10 和 -35 区域分别为 TAAGAT 和 TTGTCG，间距 19 bp，并可驱动 EGFP 表达使菌落呈绿色。
研究对象（18）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| E. coli HB101 | — | — | — | — | 用于筛选雌二醇诱导基因的宿主菌 |
| Buttiauxella strain S19-1 | 甾体降解途径 | — | — | — | 从波罗的海分离的海洋甾体降解菌，雌二醇诱导基因的来源 |
| S19-1 | 甾体降解 | gntRx | GntR transcriptional regulator | 调控 | GntR型转录调控因子，含保守N端DNA结合域，可能调控雌二醇降解，与芳香化合物降解相关GntR一致性低 |
| S19-1 | 甾体降解 | fimZ | Transcriptional regulator FimZ | 调控 | 菌毛表达调控因子 |
| S19-1 | 甾体降解 | luxR | Transcriptional regulator LuxR | 调控 | LuxR家族转录调控因子，部分成员参与甾体降解 |
| S19-1 | 甾体降解 | nadR | Transcriptional regulator nadR | 调控 | 烟酰胺核糖核苷酸调控因子 |
| S19-1 | 甾体降解 | — | Major facilitator superfamily protein | 转运 | 主要促进因子超家族膜转运蛋白，可能参与底物转运 |
| S19-1 | 甾体降解 | — | ABC transporter | 转运 | ABC转运蛋白 |
| S19-1 | 甾体降解 | sdaC | Serine transporter SdaC | 转运 | 丝氨酸转运蛋白 |
| S19-1 | 甾体降解 | — | L-serine dehydratase | 催化 | L-丝氨酸脱水酶 |
| S19-1 | 甾体降解 | — | Decarboxylase | 催化 | 脱羧酶，p302-3 |
| S19-1 | 甾体降解 | — | 7-cyano-7-deazaguanine reductase | 催化 | 7-氰-7-脱氮鸟嘌呤还原酶 |
| S19-1 | 甾体降解 | — | Glycerol dehydratase activator | 催化 | 甘油脱水酶激活蛋白 |
| S19-1 | 甾体降解 | — | Formate acetyltransferase activating enzyme | 催化 | 甲酸乙酰转移酶活化酶 |
| S19-1 | 甾体降解 | — | Histidinol-phosphate/aromatic aminotransferase | 催化 | 组氨醇磷酸/芳香族氨基转移酶 |
| S19-1 | 甾体降解 | — | Lipoate-protein ligase A | 催化 | 硫辛酸蛋白连接酶A |
| S19-1 | 甾体降解 | — | CDP-alcohol phosphatidyltransferase | 催化 | CDP-醇磷脂酰转移酶 |
| S19-1 | 启动子调控 | P_S19-1 | — | 调控 | 新鉴定的108 bp强启动子，-10区TAAGAT，-35区TTGTCG，间距19bp |
关键发现
- 从323个含SalI片段的克隆中筛选出37个雌二醇诱导克隆，其中质粒p5、p12、p22、p26、p44、p302的诱导效率（RFU-IAP）分别为6.2%、7.3%、5.7%、6.1%、5.6%和5.9%。GntRx基因开放阅读框744 bp，编码247个氨基酸，预测分子量28 kDa，与Citrobacter中GntR同源蛋白一致性81%，而与参与芳香化合物代谢的GntR一致性仅9.7-16.1%。新启动子位于108 bp片段，预测-10区为TAAGAT，-35区为TTGTCG，两者间距19 bp
- 其活性低于lac启动子（-10 TATAAT，-35 TTGACA，间距18 bp），但仍能驱动EGFP表达使菌体呈绿色。此外，质粒p302及其衍生物可被雌二醇诱导，p302-1编码L-丝氨酸脱氨酶等。
研究结论
从海洋菌S19-1中成功分离了多个雌二醇诱导基因，并发现了一个新的强启动子，该启动子有望用于构建甾体高效降解的S19-1突变株。