Enzymatic synthesis of novel branched sugar alcohols mediated by the transglycosylation reaction of pullulan-hydrolyzing amylase II (TVA II) cloned from Thermoactinomyces vulgaris R-47
- 作者
- Yoichiro Shimura, Keimei Oh, Misaki Kon, Eri Yamamoto, Yoshinori Mizuno, Takashi Adachi, Tomomi Abe, Shigeru Tamogami, Jun Fukushima, Tamio Inamoto, Takashi Tonozuka
- 单位
- Department of Biotechnology, Faculty of Bioresource Science, Akita Prefectural University; Department of Biological Production, Faculty of Bioresource Science, Akita Prefectural University; Department of Applied Biological Science, Faculty of Agriculture, Tokyo University of Agriculture and Technology
- 杂志
- Carbohydrate Research（2011）
- DOI
- 10.1016/j.carres.2011.05.030
- 所属领域
- 酶工程
- 关键词
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解决的核心问题
研究来源于Thermoactinomyces vulgaris R-47的普鲁兰多糖水解酶II（TVA II）转糖苷反应的受体特异性，探索以糖醇为受体合成新型支链低聚糖的可能性，并阐明催化裂隙边缘Trp356残基在转糖苷反应中的作用。
研究策略
以普鲁兰多糖为供体，分别以meso-赤藓糖醇、木糖醇和D-山梨糖醇为受体进行TVA II转糖苷反应；通过制备型HPLC纯化转移产物，利用NMR（1H、13C、DEPT 135、HMQC）和质谱鉴定产物结构；比较野生型TVA II与Trp356Ala突变体的反应时间进程。
核心内容
该研究以来源于Thermoactinomyces vulgaris R-47的普鲁兰多糖水解酶II（TVA II）为催化剂，探索其转糖苷反应对糖醇受体的特异性。以普鲁兰多糖为供体，分别以meso-赤藓糖醇、木糖醇和D-山梨糖醇为受体进行反应，通过制备型HPLC纯化并用NMR和质谱鉴定产物结构。结果显示TVA II可将α-panosyl单元转移至糖醇的不同羟基位置，合成五种新型非还原性支链低聚糖，各产物产率介于1.5%至5.0%之间，其中6-O-α-panosylsorbitol产率最高（80 mg，5.0%），表现出明显的羟基位置选择性。此外，将催化裂隙边缘的Trp356突变为Ala后，panose产量提高至野生型的4.0—4.5倍，但转移产物谱图与野生型一致，同时突变体对β-环糊精和淀粉的kcat/Km值分别降至野生型的1.7%和1.0%。这表明TVA II可作为合成新型支链糖醇的有效工具，且Trp356对底物识别起关键作用，其突变可显著提高水解产物panose的产量。
创新点
首次利用TVA II的转糖苷反应以糖醇为受体合成了五种新型非还原性支链低聚糖（1-O-α-panosylerythritol、1-O-α-panosylxylitol、2-O-α-panosylxylitol、1-O-α-panosylsorbitol和6-O-α-panosylsorbitol）；发现Trp356对转糖苷和水解反应中供体/受体识别具有双重作用，突变后panose产量提高4.0-4.5倍。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Thermoactinomyces vulgaris R-47 | 多糖水解与转糖苷反应 | TVA II | pullulan-hydrolyzing amylase II (TVA II) | 催化 | 来源于R-47菌株，属于糖苷水解酶家族13亚家族20，以普鲁兰多糖为供体，将α-panosyl单元转移至糖醇受体 |
| Escherichia coli MV1184 | 重组蛋白表达 | TVA II | 重组TVA II及其突变体 | 催化 | 用于表达和纯化野生型TVA II及Trp356Ala突变体 |
| Escherichia coli MV1184 | 重组蛋白表达 | TVA II (Trp356Ala) | Trp356Ala突变体TVA II | 催化 | Trp356突变为Ala后，panose产量比野生型提高4.0-4.5倍，但转糖苷产物类型不变 |
关键发现
- TVA II将α-panosyl单元转移至meso-赤藓糖醇的C-1羟基、木糖醇的C-1和C-2羟基、D-山梨糖醇的C-1和C-6羟基，生成五种新化合物
- 产物产量分别为24 mg(E-2)、69 mg(X-1)、56 mg(X-2)、27 mg(S-1)、80 mg(S-2)，对应产率1.5%、4.3%、3.5%、1.7%、5.0%
- ESI-MS分子离子峰m/z分别为607.2、637.1、637.4、667.1、667.1
- Trp356Ala突变体的panose产量为野生型的4.0-4.5倍，但转移产物HPLC图谱与野生型一致
- 突变体对β-环糊精和淀粉的kcat/Km值分别降至野生型的1.7%和1.0%。
研究结论
TVA II能够以糖醇为受体通过转糖苷反应合成多种新型非还原性支链低聚糖，且具有羟基位置选择性；Trp356位于催化裂隙+2亚位点边缘，对水解和转糖苷反应的底物识别起关键作用，突变Trp356为Ala可显著提高panose产量。